Proteinase K mNGS (lỏng)
Proteinase K là một protease serine ổn định với tính đặc hiệu cơ chất rộng.Nó làm suy giảm nhiều protein ở trạng thái tự nhiên ngay cả khi có chất tẩy rửa.Bằng chứng từ các nghiên cứu về cấu trúc tinh thể và phân tử cho thấy enzyme này thuộc họ subtilisin với bộ ba xúc tác tại vị trí hoạt động (Asp39-Của anh ấy69-Ser224).Vị trí phân cắt chủ yếu là liên kết peptide liền kề với nhóm carboxyl của axit amin béo và thơm với các nhóm alpha amino bị chặn.Nó thường được sử dụng vì tính đặc hiệu rộng rãi của nó.Proteinase K này được thiết kế đặc biệt cho mNGS.So với proteinase K khác, nó thậm chí còn chứa ít ô nhiễm axit nucleic hơn với cùng hiệu suất enzyme, điều này có thể đảm bảo tốt hơn cho ứng dụng mNGS ở hạ lưu.
Điều kiện bảo quản
2-8oC trong 2 năm
Sự chỉ rõ
| Vẻ bề ngoài | Chất lỏng không màu đến màu nâu nhạt |
| Hoạt động | ≥800 U/ml |
| Nồng độ protein | ≥20 mg/ml |
| biệt danh | Không phát hiện thấy |
| DNase | Không phát hiện thấy |
| RNase | Không phát hiện thấy |
Của cải
| số EC | 3.4.21.64(Tái tổ hợp từ album Tritirachium) |
| Điểm đẳng điện | 7,81 |
| pH tối ưu | 7,0- 12,0 Hình 1 |
| Nhiệt độ tối ưu | 65oC Hình 2 |
| độ pH ổn định | pH 4,5- 12,5 (25oC, 16 giờ) Hình 3 |
| Ổn định nhiệt | Dưới 50oC (pH 8,0, 30 phút) Hình 4 |
| Độ ổn định lưu trữ | Hoạt động trên 90% trong 12 tháng ở 25oC |
| Trình kích hoạt | SDS, urê |
| chất ức chế | Diisopropyl fluorophosphate;phenylmetylsulfonyl florua |
Các ứng dụng
1. Bộ chẩn đoán di truyền
2. Bộ dụng cụ tách chiết RNA và DNA
3. Chiết xuất các thành phần phi protein từ mô, phân hủy các tạp chất protein, chẳng hạn như DNAvắc xin và điều chế heparin
4. Chuẩn bị DNA nhiễm sắc thể bằng phương pháp điện di xung
5. Western blot
6. Chẩn đoán in vitro thuốc thử albumin glycosyl hóa bằng enzyme
Các biện pháp phòng ngừa
Đeo găng tay và kính bảo hộ khi sử dụng hoặc cân và giữ thông gió tốt sau khi sử dụng.Sản phẩm này có thể gây phản ứng dị ứng da và kích ứng mắt nghiêm trọng.Nếu hít phải có thể gây dị ứng hoặc có triệu chứng hen suyễn hoặc khó thở.Có thể gây kích ứng đường hô hấp.
định nghĩa đơn vị
Một đơn vị (U) được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để thủy phân casein để tạo ra 1 μmoltyrosine mỗi phút trong các điều kiện sau.
Chuẩn bị thuốc thử
Thuốc thử I: 1g casein sữa hòa tan trong 50ml dung dịch natri photphat 0,1M (pH 8,0), ủ trong nước 65-70oC trong 15 phút, khuấy và hòa tan, làm nguội bằng nước, điều chỉnh bằng natri hydroxit đến pH 8,0 và cố định thể tích 100ml.
Thuốc thử II: Axit trichloroacetic 0,1M, natri axetat 0,2M, axit axetic 0,3M.
Thuốc thử III: 0,4M Na2CO3giải pháp.
Thuốc thử IV: Thuốc thử Forint pha loãng với nước tinh khiết 5 lần.
Thuốc thử V: Chất pha loãng enzyme: dung dịch natri photphat 0,1M (pH 8,0).
Thuốc thử VI: dung dịch tyrosine: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tyrosine hòa tan với 0,2MHCl.
Thủ tục
1. 0,5ml thuốc thử I được làm ấm trước đến 37oC, thêm 0,5ml dung dịch enzyme, trộn đều và ủ ở nhiệt độ37oC trong 10 phút.
2. Thêm 1ml thuốc thử II để dừng phản ứng, trộn đều và tiếp tục ủ trong 30 phút.
3. Ly tâm dung dịch phản ứng.
4. Lấy 0,5ml chất nổi phía trên, thêm 2,5ml thuốc thử III, 0,5ml thuốc thử IV, trộn đều và ủ ở 37oCtrong 30 phút.
5. OD660được xác định là OD1;nhóm chứng trống: 0,5ml thuốc thử V được dùng để thay thế enzymegiải pháp xác định OD660như OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. Đường chuẩn L-tyrosine: 0,5mL dung dịch L-tyrosine nồng độ khác nhau, 2,5mL thuốc thử III, 0,5mL thuốc thử IV trong ống ly tâm 5mL, ủ trong 37oC trong 30 phút, phát hiện OD660đối với nồng độ L-tyrosine khác nhau, sau đó thu được đường chuẩn Y=kX+b, trong đó Y là nồng độ L-tyrosine, X là OD600.
Phép tính
2: Tổng thể tích dung dịch phản ứng (mL)
0,5: Thể tích dung dịch enzyme (mL)
0,5: Thể tích chất lỏng phản ứng được sử dụng trong xác định màu sắc (mL)
10: Thời gian phản ứng (phút)
Df: Pha loãng nhiều lần
C: Nồng độ enzyme (mg/mL)
Người giới thiệu
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Hóa sinh.Sinh lý.Res.Cộng đồng.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,Euro.J. Hóa sinh.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Nhân bản phân tử: Cẩm nang phòng thí nghiệm, tái bản lần thứ 2, Cold Spring HarborNhà xuất bản Phòng thí nghiệm, Cold Spring Harbor (1989).
Số liệu
Quả sung.1 Tối ưu pH
Dung dịch đệm 100mM: pH6,0-8,0, Na-phosphate;pH8,0-9,0, Tris-HCl;pH9.0-12.5, nồng độ Glycine-NaOH.Enzyme: 1mg/mL
Hình 2 Nhiệt độ tối ưu
Phản ứng trong dung dịch đệm K-phosphate 20 mM pH 8,0.Nồng độ enzym: 1 mg/mL
Hình 3 pH Sự ổn định
Xử lý 25oC, 16 giờ với dung dịch đệm 50 mM: pH 4,5- 5,5, Acetate;pH 6,0-8,0, Na-photphat;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0- 12,5, Glycine-NaOH.Nồng độ enzym: 1 mg/mL
Hình 4 Nhiệt sự ổn định
Xử lý 30 phút với dung dịch đệm Tris-HCl 50 mM, pH 8,0.Nồng độ enzym: 1 mg/mL
Hình 5 Lưu trữ sự ổn địnhty at 25oC
