Phiên mã ngược RTL
Enzym phiên mã ngược RTL là một DNA polymerase phụ thuộc vào khuôn mẫu RNA, thiếu hoạt tính exonuclease 3'→5' và có hoạt tính RNase H.Enzyme này có thể sử dụng RNA làm khuôn để tổng hợp chuỗi DNA bổ sung, có thể áp dụng cho quá trình tổng hợp cDNA chuỗi đầu tiên, đặc biệt là cho RT-LAMP (khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng lặp).So với enzyme phiên mã ngược RTL 1.0, độ nhạy được cải thiện đáng kể, độ ổn định nhiệt mạnh hơn và phản ứng ở 65°C ổn định hơn.Enzyme phiên mã ngược RTL (không chứa glycerol) có thể được sử dụng để điều chế các chế phẩm đông khô, thuốc thử RT-LAMP đông khô, v.v.
Định nghĩa đơn vị
Một đơn vị kết hợp 1nmol dTTP vào vật liệu kết tủa axit trong 20 phút ở 50°C bằng cách sử dụng poly(A)·oligo(dT)25 làm lớp lót mẫu.
Các thành phần
| Thành phần | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| Enzyme phiên mã ngược RTL (không chứa Glycerol) (15U/μL) | 0,1mL | 1mL | 10mL |
| Bộ đệm RTL 10×HC | 1,5mL | 4 × 1,5mL | 5×10mL |
| MgSO4 (100mM) | 1,5mL | 2 × 1,5mL | 3×10mL |
Điều kiện lưu trữ
Vận chuyển dưới 0°C và bảo quản ở -25°C~-15°C.
Kiểm soát chất lượng
- Hoạt động dư thừa củaEndonuclease:Phản ứng 50 μL chứa 1 μg λDNA và 15 đơn vị RTL2.0 được ủ trong 16 giờ ở 37 oC cho thấy mô hình tương tự như kiểm soát âm tính bằng điện di trên gel.
- Hoạt động dư thừa củaExonuclease:Phản ứng 50 µL chứa 1 µg Hind Ⅲ đã tiêu hóa λDNA và 15 đơn vị RTL2.0 được ủ trong 16 giờ ở 37 oC cho thấy mô hình tương tự như đối chứng âm tính bằng điện di trên gel.
- Hoạt động dư thừa củabiệt danh:Phản ứng 50 μL chứa 1 μg pBR322 siêu xoắn và 15 đơn vị RTL2.0 được ủ trong 4 giờ ở 37°C cho thấy mô hình tương tự như đối chứng âm bằng phương pháp điện di trên gel.
- Hoạt động dư thừa củaRNase:Phản ứng 10 μL chứa 0,48 μg MS2 RNA và 15 đơn vị RTL2.0 được ủ trong 4 giờ ở 37°C cho thấy mô hình tương tự như đối chứng âm bằng phương pháp điện di trên gel.
- E coli gADN:Đo bằngE colibộ phát hiện HCD cụ thể, 15 đơn vị RTL2.0 chứa ít hơn 1E colibộ gen.
Thiết lập phản ứng
Giao thức tổng hợp cDNA
| Các thành phần | Âm lượng |
| RNA mẫu a | không bắt buộc |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) hoặc Hỗn hợp mồi ngẫu nhiên(60uM) | 2 µL |
| Hỗn hợp dNTP (mỗi loại 10mM) | 1 µL |
| Chất ức chế RNase (40U/uL) | 0,5 µL |
| Phiên mã ngược RTL 2.0 (15U/uL) | 0,5 µL |
| Bộ đệm RTL 10×HC | 2 µL |
| Nước không có Nuclease | Lên đến 20 µL |
Ghi chú:
1) Liều lượng khuyến nghị của Tổng RNA là 1ng ~ 1μg
2) Liều lượng khuyến nghị của mRNA là 50ng ~ 100ng
Nhiệt-Đi xe đạp Điều kiện cho một thói quen sự phản ứng lại:
| Nhiệt độ (°C) | Thời gian |
| 25°Ca | 5 phút |
| 55°C | 10 phútb |
| 80°C | 10 phút |
Ghi chú:
1) Nếu sử dụng Hỗn hợp mồi ngẫu nhiên, bước ủ ở 25°C.
2) Nếu sử dụng hỗn hợp mồi mục tiêu, bước ủ ở 55°C trong 10 ~ 30 phút.
Giao thức RT-LAMP
| Các thành phần | Âm lượng | Nồng độ cuối cùng |
| RNA mẫu | không bắt buộc | ≥10 bản |
| Hỗn hợp dNTP (10mM) | 3,5 µL | 1,4 mM |
| Sơn lót FIP/BIP (25×) | 1 µL | 1,6 triệu |
| Sơn lót F3/B3 (25×) | 1 µL | 0,2 μM |
| Mồi LoopF/LoopB (25×) | 1 µL | 0,4 μM |
| Chất ức chế RNase (40U/μL) | 0,5 µL | 20 U/Phản ứng |
| Phiên mã ngược RTL 2.0 (15U/μL) | 0,5 µL | 7,5 U/Phản ứng |
| DNA Polymerase Bst V2 (8U/μL) | 1 µL | 8 U/Phản ứng |
| MgSO4 (100mM) | 1,5 µL | 6 mM (Tổng cộng 8 mM) |
| Bộ đệm 10×HC RTL (hoặc Bộ đệm 10×HC Bst V2) | 2,5 µL | 1 × (2mM Mg2+) |
| Nước không có Nuclease | Lên đến 25 µL | - |
Ghi chú:
1) Trộn bằng cách vortex và ly tâm nhanh để thu thập.Ủ ở nhiệt độ không đổi ở 65°C trong 1 giờ.
2) Hai bộ đệm có thể tương tác với nhau và có cùng thành phần.
Ghi chú
1. Sản phẩm này sẽ tạo thành chất rắn màu trắng khi được bảo quản ở -20 ° C.Lấy nó ra khỏi nhiệt độ -20°C và cho vào đá khoảng 10 phút.Sau khi tan chảy, nó có thể được sử dụng bằng cách lắc và trộn.
2. Sản phẩm cDNA có thể được bảo quản ở -20°C hoặc -80°C hoặc sử dụng ngay cho phản ứng PCR.
3. Để ngăn ngừa ô nhiễm RNase, vui lòng giữ sạch sẽ khu vực thí nghiệm và đeo găng tay và khẩu trang sạch trong quá trình vận hành.
