Proteinase K (Bột đông khô)
Mã số: HC4500A
Proteinase K là một protease serine ổn định với tính đặc hiệu cơ chất rộng.Nó làm suy giảm nhiều protein ở trạng thái tự nhiên ngay cả khi có chất tẩy rửa.Bằng chứng từ các nghiên cứu về cấu trúc tinh thể và phân tử cho thấy enzyme này thuộc họ subtilisin với bộ ba xúc tác tại vị trí hoạt động (Asp39-Của anh ấy69- Ser224).Vị trí phân cắt chủ yếu là liên kết peptide liền kề với nhóm carboxyl của axit amin béo và thơm với các nhóm alpha amino bị chặn.Nó thường được sử dụng rộng rãitính đặc hiệu.
Điều kiện bảo quản
Lưu trữ ngắn hạn 2-8oC, lưu trữ dài hạn -25 ~ -15oC.Trạng thái bột khô -25~-15oC có giá trị trong 3 năm;bột enzyme nên được hòa tan vào thể tích thích hợp.
Sự chỉ rõ
| Vẻ bề ngoài | Bột đông khô vô định hình màu trắng đến trắng nhạt |
| Hoạt động | ≥30 U/mg |
| DNase | Không phát hiện thấy |
| RNase | Không phát hiện thấy |
Của cải
| số EC | 3.4.21.64 (Tái tổ hợp từ album Tritirachium) |
| Trọng lượng phân tử | 29 kDa (TRANG SDS) |
| Điểm đẳng điện | 7,81 |
| pH tối ưu | 7,0-12,0 Hình 1 |
| Nhiệt độ tối ưu | 65oC Hình 2 |
| độ pH ổn định | pH 4,5-12,5 (25oC, 16h) Hình 3 |
| Ổn định nhiệt | Dưới 50oC (pH 8,0, 30 phút) Hình 4 |
| Trình kích hoạt | SDS, urê |
| chất ức chế | Diisopropyl fluorophosphate;phenylmetylsulfonyl florua |
Các ứng dụng
1. Bộ chẩn đoán di truyền
2. Bộ dụng cụ tách chiết RNA và DNA
3. Chiết xuất các thành phần phi protein từ mô, phân hủy tạp chất protein, chẳng hạn như vắc xin DNA và điều chế heparin
4. Chuẩn bị DNA nhiễm sắc thể bằng phương pháp điện di xung
5. Western blot
6. Chẩn đoán in vitro thuốc thử albumin glycosyl hóa bằng enzyme
Các biện pháp phòng ngừa
Đeo găng tay và kính bảo hộ khi sử dụng hoặc cân và giữ thông gió tốt sau khi sử dụng.Sản phẩm này có thể gây phản ứng dị ứng da và kích ứng mắt nghiêm trọng.Nếu hít phải có thể gây dị ứng hoặc có triệu chứng hen suyễn hoặc khó thở.Có thể gây kích ứng đường hô hấp.
xét nghiệm
định nghĩa đơn vị
Một đơn vị (U) được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để thủy phân casein để tạo ra 1 μmol tyrosine mỗi phút trong các điều kiện sau.
Chuẩn bị thuốc thử
Thuốc thử I: 1g casein sữa hòa tan trong 50ml dung dịch natri photphat 0,1M (pH 8,0), ủ trong nước 65-70oC trong 15 phút, khuấy và hòa tan, làm nguội bằng nước, điều chỉnh bằng natri hydroxit đến pH 8,0 và cố định thể tích 100ml.
Thuốc thử II: Axit trichloroacetic 0,1M, natri axetat 0,2M, axit axetic 0,3M.
Thuốc thử III: 0,4M Na2CO3giải pháp.
Thuốc thử IV: Thuốc thử Forint pha loãng với nước tinh khiết 5 lần.
Thuốc thử V: chất pha loãng enzyme: dung dịch natri photphat 0,1M (pH 8,0).
Thuốc thử VI: dung dịch tyrosine: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tyrosine hòa tan với HCL 0,2M.
Thủ tục
1. 0,5ml thuốc thử I được làm ấm trước đến 37oC, thêm 0,5ml dung dịch enzyme, trộn đều và ủ ở 37oC trong 10 phút.
2. Thêm 1 ml thuốc thử II để dừng phản ứng, trộn đều và tiếp tục ủ trong 30 phút.
3. Ly tâm dung dịch phản ứng.
4. Lấy 0,5ml chất nổi phía trên, thêm 2,5ml thuốc thử III, 0,5ml thuốc thử IV, trộn đều và ủ ở 37oC trong 30 phút.
5. OD660được xác định là OD1;Nhóm chứng trống: Dùng 0,5ml thuốc thử V thay thế dung dịch enzyme để xác định OD660như OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. Đường chuẩn L-tyrosine: 0,5mL dung dịch L tyrosine nồng độ khác nhau, 2,5mL thuốc thử III, 0,5mL thuốc thử IV trong ống ly tâm 5mL, ủ trong 37oC trong 30 phút, phát hiện OD660đối với nồng độ L-tyrosine khác nhau thì thu được đường chuẩn Y=kX+b, trong đó Y là nồng độ L-tyrosine, X là OD600.
Phép tính
2: Tổng thể tích dung dịch phản ứng (mL)
0,5: Thể tích dung dịch enzyme (mL)
0,5: Thể tích chất lỏng phản ứng được sử dụng trong xác định màu sắc (mL)
10: Thời gian phản ứng (phút)
Df: Pha loãng nhiều lần
C: Nồng độ enzyme (mg/mL)
Người giới thiệu
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Hóa sinh.Sinh lý.Res.Cộng đồng.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,Euro.J. Hóa sinh.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Nhân bản phân tử: Cẩm nang Phòng thí nghiệm, tái bản lần thứ 2, Nhà xuất bản Phòng thí nghiệm Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor (1989).
Hình 2 Nhiệt độ tối ưu
Phản ứng trong dung dịch đệm K-phosphate 20 mM pH 8,0.Nồng độ enzyme: 1mg/mL
Hình 3 pH Sự ổn định
Xử lý 25oC, 16 giờ với dung dịch đệm 50mM: pH 4,5-5,5, Acetate;pH 6,0-8,0, Na-photphat;pH 8,0-9,0, Tris-HCL.pH 9,0-12,5, Glycine-NaOH.Nồng độ enzyme: 1mg/mL
Hình 4 Nhiệt sự ổn định
Xử lý 30 phút với dung dịch đệm Tris-HCL 50mM, pH 8,0.Nồng độ enzyme: 1mg/mL
Hình 5 Lưu trữ sự ổn địnhty at 25oC
