5×Neoscript Fast RT-qPCR Premix plus-UNG
Mã số: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) là hỗn hợp dựa trên đầu dò một ống có độ ổn định cao phù hợp cho sao chép ngược một bước và PCR định lượng (qRT-PCR).Nó hỗ trợ trộn trước mồi và đầu dò và duy trì ổn định sau thời gian dài bảo quản ở nhiệt độ thấp.Mẫu cần kiểm tra có thể được thêm trực tiếp khi sử dụng mà không cần thao tác mở/rút ống thêm.Sản phẩm này cung cấp các thành phần, ví dụ như DNA polymerase khởi động nóng, M-MLV, DNA glycosylase uracil không bền với nhiệt (TS-UNG), Chất ức chế RNase, MgCl2, dNTP (với dUTP thay vì dTTP) và chất ổn định.Với men sao chép ngược khuếch đại nhanh biến đổi gen và DNA polymerase, có thể hoàn thành quá trình khuếch đại PCR trong vòng 20-40 phút.Thuốc thử này sử dụng dung dịch đệm đặc biệt cho qPCR với hỗn hợp enzyme khuếch đại chống ức chế và enzyme UNG.Do đó, nó có thể thu được sự khuếch đại tốt các gen mục tiêu và ngăn chặn sự khuếch đại sai do ô nhiễm dư lượng PCR và khí dung gây ra.Thuốc thử này tương thích với hầu hết các thiết bị PCR định lượng huỳnh quang của các nhà sản xuất như Ứng dụng Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad và Roche.
Thành phần
1.Hỗn hợp RTase nhanh/UNG 25 × Neoscript
2.Bộ đệm trộn sẵn RT nhanh 5×Neoscript (dUTP)
Điều kiện bảo quản
Tất cả các thành phần phải được giữ ở -20oC để lưu trữ lâu dài và 4oC trong tối đa 3 tháng.Vui lòng trộn kỹ sau khi rã đông và ly tâm trước khi sử dụng.Tránh đóng băng-tan băng thường xuyên.
Chuẩn bị hệ thống phản ứng qRT-PCR
| Các thành phần | 25μLHệ thống | 50μLHệ thống | Nồng độ cuối cùng |
| Bộ đệm trộn sẵn RT nhanh 5×Neoscript (dUTP) | 5μL | 10μL | 1× |
| Hỗn hợp RTase nhanh/UNG 25 × Neoscript | 1μL | 2μL | 1× |
| Hỗn hợp đầu dò mồi 25×a | 1μL | 2μL | 1× |
| RNA mẫub | – | – | – |
| ddH2O | Lên đến 25μL | Lên đến 50μL | – |
1) a.Nồng độ cuối cùng của sơn lót thường là 0,2μM.Để có kết quả tốt hơn, nồng độ mồi có thể được tối ưu hóa trong khoảng 0,2-1μM.Nói chung, nồng độ đầu dò có thể được tối ưu hóa trong khoảng 0,1-0,3μM.
2) b.Khi sử dụng Quy trình PCR nhanh, việc tăng nồng độ mồi và mẫu dò có thể mang lại kết quả khuếch đại tốt hơn và tỷ lệ của chúng phải được tối ưu hóa tương ứng.
3) Các loại mẫu khác nhau chứa các loại và hàm lượng chất ức chế cũng như số lượng bản sao của gen mục tiêu khác nhau.Khối lượng mẫu cần được xem xét theo điều kiện thực tế.Pha loãng mẫu bằng nước không có nuclease hoặc đệm TE, nếu cần.
Phản ứng Cđiều kiện
| Quy trình PCR thông thường | Quy trình PCR nhanh | ||||||
| Thủ tục | Nhiệt độ. | Thời gian | Xe đạp | Thủ tục | Nhiệt độ. | Thời gian | Xe đạp |
| Phiên mã ngược | 50oC | 10-20 phút | 1 | Phiên mã ngược | 50oC | 5 phút | 1 |
| Polymerase Kích hoạt | 95oC | 1-5 phút | 1 | Polymerase Kích hoạt | 95oC | 30 tuổi | 1 |
| Biến tính | 95oC | 10-20 giây | 40-50 | Biến tính | 95oC | 1-3 giây | 40-50 |
| Ủ Và Sự mở rộng | 56-64oC | 20-60 tuổi | Ủ Và Sự mở rộng | 56-64oC | 3-20s | ||
Kiểm soát chất lượng
1.Phát hiện chức năng: độ nhạy, độ đặc hiệu và độ lặp lại của qPCR.
2.Không có hoạt động nuclease ngoại sinh: không gây ô nhiễm endnuclease và exonuclease ngoại sinh.
Ghi chú
1.Tốc độ khuếch đại của DNA polymerase nhanh không dưới 1kb/10s.Các thiết bị PCR khác nhau có tốc độ làm nóng và làm mát khác nhau, các chế độ kiểm soát nhiệt độ và độ dẫn nhiệt, do đó việc tối ưu hóa nồng độ mồi/đầu dò và phương pháp chạy kết hợp với thiết bị PCR nhanh cụ thể của bạn là điều cần thiết.
2.Sản phẩm này có khả năng ứng dụng rộng rãi và phù hợp cho chẩn đoán phân tử có độ nhạy cao.Phương pháp PCR ba bước được khuyến nghị sử dụng cho các mồi có nhiệt độ gắn mồi thấp hoặc để khuếch đại các đoạn dài trên 200 bp.
3.Do các bộ khuếch đại khác nhau có hiệu suất sử dụng dUTP khác nhau và độ nhạy khác nhau với UNG, nên thuốc thử phải được tối ưu hóa nếu độ nhạy phát hiện giảm khi sử dụng hệ thống UNG.Hãy liên hệ với chúng tôi để được hỗ trợ kỹ thuật nếu cần.
4.Để tránh khuếch đại các sản phẩm PCR chuyển tiếp, cần có khu vực thí nghiệm chuyên dụng và pipet để khuếch đại.Sử dụng găng tay và thay thường xuyên và không mở ống PCR sau khi khuếch đại.
