Universal SYBR GREEN qPCR Premix (Xanh dương)
Mã số: HCB5041B
Universal Blue qPCR Master Mix (Dye Based) là giải pháp tiền xử lý cho khuếch đại PCR định lượng thời gian thực 2× được đặc trưng bởi độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có màu xanh lam và có tác dụng theo dõi thêm mẫu.Thành phần cốt lõi Taq DNA polymerase sử dụng kháng thể khởi động nóng để ức chế hiệu quả sự khuếch đại không đặc hiệu do ủ mồi trong quá trình chuẩn bị mẫu.Đồng thời, công thức bổ sung yếu tố thúc đẩy nhằm nâng cao hiệu quả khuếch đại của phản ứng PCR và cân bằng quá trình khuếch đại của các gen có hàm lượng GC khác nhau (30 ~ 70%), để PCR định lượng có thể thu được mối quan hệ tuyến tính tốt trong phạm vi định lượng rộng. vùng đất.Sản phẩm này chứa Thuốc nhuộm tham chiếu thụ động ROX đặc biệt, có thể áp dụng cho hầu hết các thiết bị qPCR.Không cần thiết phải điều chỉnh nồng độ ROX trên các thiết bị khác nhau.Chỉ cần thêm mồi và mẫu để chuẩn bị cho hệ thống phản ứng khuếch đại.
Các thành phần
Hỗn hợp tổng thể qPCR màu xanh phổ quát
Điều kiện bảo quản
Sản phẩm được vận chuyển kèm túi nước đá và có thể bảo quản ở -25oC~-15oC trong 18 tháng.Cần tránh chiếu xạ ánh sáng mạnh khi bảo quản hoặc chuẩn bị hệ thống phản ứng.
Sự chỉ rõ
| Sự tập trung | 2× |
| Phương pháp phát hiện | SYBR |
| phương pháp PCR | qPCR |
| Polymerase | Taq DNA polymerase |
| Loại mẫu | ADN |
| Thiết bị ứng dụng | Hầu hết các thiết bị qPCR |
| Loại sản phẩm | Hỗn hợp SYBR cho PCR định lượng huỳnh quang thời gian thực |
| Áp dụng cho (ứng dụng) | Biểu hiện gen |
Hướng dẫn
1. Hệ thống phản ứng
| Các thành phần | Khối lượng(μL) | Khối lượng(μL) | Nồng độ cuối cùng |
| Hỗn hợp sẵn SYBR GREEN qPCR phổ biến | 25 | 10 | 1× |
| Sơn lót chuyển tiếp (10μmol/L) | 1 | 0,4 | 0,2μmol/L |
| Sơn lót ngược (10μmol/L) | 1 | 0,4 | 0,2μmol/L |
| ADN | X | X | |
| ddH2O | lên đến 50 | lên đến 20 | - |
[Lưu ý]: Trộn kỹ trước khi sử dụng để tránh tạo bọt quá nhiều do lắc mạnh.
a) Nồng độ mồi: Nồng độ mồi cuối cùng là 0,2μmol/L và cũng có thể được điều chỉnh trong khoảng 0,1 đến 1,0μmol/L nếu thích hợp.
b) Nồng độ mẫu: Nếu mẫu là dung dịch gốc cDNA không pha loãng, thể tích sử dụng không được vượt quá 1/10 tổng thể tích của phản ứng qPCR.
c) Pha loãng mẫu: Nên pha loãng dung dịch gốc cDNA từ 5-10 lần.Lượng mẫu được thêm vào tối ưu sẽ tốt hơn khi giá trị Ct thu được khi khuếch đại là 20-30 chu kỳ.
d) Hệ thống phản ứng: Nên sử dụng 20μL hoặc 50μL để đảm bảo hiệu quả và độ lặp lại của quá trình khuếch đại gen mục tiêu.
e) Chuẩn bị hệ thống: Vui lòng chuẩn bị trên bàn siêu sạch và sử dụng các đầu tip và ống phản ứng không có cặn nuclease;nên sử dụng các mẹo với hộp lọc.Tránh ô nhiễm chéo và ô nhiễm khí dung.
2.Chương trình phản ứng
Chương trình tiêu chuẩn
| Bước chu kỳ | Nhiệt độ. | Thời gian | Chu kỳ |
| Biến tính ban đầu | 95oC | 2 phút | 1 |
| Biến tính | 95oC | 10 giây | 40 |
| Ủ/Mở rộng | 60oC | 30 giây★ | |
| Giai đoạn đường cong nóng chảy | Mặc định của công cụ | 1 | |
Chương trình nhanh
| Bước chu kỳ | Nhiệt độ. | Thời gian | Chu kỳ |
| Biến tính ban đầu | 95oC | 30 giây | 1 |
| Biến tính | 95oC | 3 giây | 40 |
| Ủ/Mở rộng | 60oC | 20 giây★ | |
| Giai đoạn đường cong nóng chảy | Mặc định của công cụ | 1 | |
[Lưu ý]: Chương trình nhanh phù hợp với đại đa số các gen và các chương trình tiêu chuẩn có thể được thử cho các gen cấu trúc thứ cấp phức tạp riêng lẻ.
a) Nhiệt độ và thời gian ủ: Vui lòng điều chỉnh theo chiều dài mồi và gen mục tiêu.
b) Thu tín hiệu huỳnh quang (★): Vui lòng thiết lập quy trình thí nghiệm theo yêu cầu trong hướng dẫn sử dụng thiết bị.
c) Đường cong nóng chảy: Chương trình mặc định của thiết bị có thể được sử dụng bình thường.
3. Phân tích kết quả
Cần tối thiểu ba bản sao sinh học cho các thí nghiệm định lượng.Sau phản ứng, đường cong khuếch đại và đường cong nóng chảy cần được xác nhận.
3.1 Đường cong khuếch đại:
Đường cong khuếch đại tiêu chuẩn có hình chữ S.Phân tích định lượng chính xác nhất khi giá trị Ct nằm trong khoảng từ 20 đến 30. Nếu giá trị Ct nhỏ hơn 10 thì cần pha loãng mẫu và tiến hành xét nghiệm lại.Khi giá trị Ct nằm trong khoảng 30-35, cần tăng nồng độ mẫu hoặc thể tích của hệ thống phản ứng để nâng cao hiệu suất khuếch đại và đảm bảo độ chính xác của phân tích kết quả.Khi giá trị Ct lớn hơn 35, kết quả xét nghiệm không thể phân tích định lượng biểu hiện của gen nhưng có thể dùng để phân tích định tính.
3.2 Đường cong nóng chảy:
Đỉnh đơn của đường cong nóng chảy cho thấy độ đặc hiệu của phản ứng tốt và có thể thực hiện phân tích định lượng;nếu đường cong nóng chảy có hai hoặc nhiều đỉnh thì không thể thực hiện phân tích định lượng.Đường cong nóng chảy cho thấy các đỉnh kép và cần đánh giá xem đỉnh không phải mục tiêu là dimer mồi hay khuếch đại không đặc hiệu bằng phương pháp điện di trên gel DNA agarose.Nếu là dimer mồi thì nên giảm nồng độ mồi hoặc thiết kế lại mồi có hiệu suất khuếch đại cao.Nếu là khuếch đại không đặc hiệu, vui lòng tăng nhiệt độ ủ hoặc thiết kế lại mồi có độ đặc hiệu.
Ghi chú
Vui lòng mặc PPE cần thiết, chẳng hạn như áo khoác và găng tay phòng thí nghiệm, để đảm bảo sức khỏe và sự an toàn của bạn!
Sản phẩm này là dành cho chỉ sử dụng nghiên cứu!
