Bộ PCR trực tiếp thực vật

Mã số: HCR2020A

Bộ PCR trực tiếp thực vật thích hợp để khuếch đại trực tiếp lá, hạt cây, v.v. và có thể được sử dụng để sàng lọc thông lượng cao các mẫu thực vật không chứa polysacarit và polyphenol.DNA polymerase khuếch đại trực tiếp dựa trên quá trình tiến hóa có định hướng có khả năng chống chịu vượt trội đối với các chất ức chế PCR ở thực vật.Trong khi đó, nó duy trì hiệu suất khuếch đại cao, phù hợp cho việc khuếch đại các đoạn DNA trong phạm vi 5 kb.Bộ đệm Lysis A độc đáo trong bộ sản phẩm có thể được sử dụng để ly giải các mô thực vật tươi hoặc đông lạnh.Nó rất dễ vận hành và lysate có thể được sử dụng làm khuôn mẫu để khuếch đại mà không cần tinh chế.Hệ thống này chứa các chất bảo vệ cho phép khuếch đại hiệu quả các mẫu thô sau khi đông lạnh và tan băng nhiều lần.2 × Plant Direct Master Mix chỉ cần thêm mồi và mẫu để thực hiện phản ứng khuếch đại, từ đó giảm thao tác sử dụng pipet và cải thiện năng suất phát hiện cũng như khả năng tái tạo kết quả.

Các thành phần

*Bộ đệm ly giải trực tiếp thực vật B là thuốc thử tùy chọn, được sử dụng để trung hòa Bộ đệm ly giải trực tiếp thực vật A để kéo dài thời gian bảo quản mẫu.Nó có thể được sử dụng theo tình hình thực tế.

Điều kiện bảo quản

2 × Plant Direct Master Mix, bảo quản ở -30 ~ -15oC và tránh đóng băng và tan băng nhiều lần;Dung dịch đệm ly giải trực tiếp thực vật, bảo quản ở -30 ~ -15oC hoặc 2 ~ 8oC.

Quá trình thử nghiệm

Xử lý mẫu–Lá cây

Phương pháp trực tiếp:Nên sử dụng lá non.Sử dụng dụng cụ đục lỗ có đường kính cố định 0,5 – 3 mm để thu được mẫu nhỏ và đồng nhất, sau đó thêm mẫu trực tiếp vào hệ thống PCR (nên sử dụng hệ thống 50 μl).Lưu ý, đảm bảo mẫu nằm trong dung dịch PCR và không tựa vào thành ống.Nếu PCR trực tiếp được sử dụng để khuếch đại các đoạn dài và mẫu phức tạp, sử dụng mẫu có đường kính nhỏ hơn (0,5 – 1 mm) làm mẫu có thể giúp thu được kết quả tốt hơn.

Phương pháp ly giải mài:Nên sử dụng lá non.Lấy một mảnh lá nhỏ (đường kính khoảng 1 – 3 mm), cho vào 20 µl Plant Direct Lysis Buffer Ab và nghiền càng nhiều càng tốt (bước này có thể được thực hiện bằng cách ép lá bằng đầu pipet 100 µl. để nghiền mẫu).Nếu sử dụng thể tích mô lá lớn hơn (không vượt quá 7 mm), hãy tăng thể tích dung dịch đệm pha loãng lên 50 µl.Sau khi nghiền lá, dung dịch sẽ có màu xanh.Sau một thời gian ly tâm ngắn, thêm 1 µl chất nổi phía trên vào hệ thống PCR làm mẫu phản ứngc.

Phương pháp ly giải nhiệt:Nên sử dụng lá non.Lấy một mảnh lá nhỏ (đường kính khoảng 1 – 3 mm), cho vào 20 µl Plant Direct Lysis Buffer A, và đun nóng ở 95°C trong 5 – 10 phút.Thời gian ly giải có thể được kéo dài một cách thích hợp đối với những lá khó ly giải (không quá 20 phút).Nếu sử dụng thể tích mô lá lớn hơn (không vượt quá 7 mm), hãy tăng thể tích dung dịch đệm pha loãng lên 50 µl.Sau khi đun nóng, ly tâm nhanh và thêm 1 µl chất nổi phía trên vào hệ thống PCR làm mẫu phản ứngb.

Xử lý mẫu–Hạt giống cây trồng

Phương pháp ly giải mài:Sử dụng dao mổ để cắt hạt có đường kính 5 mm, thêm chúng vào 100 µl Dung dịch đệm ly giải trực tiếp thực vật A và nghiền mẫu bằng đầu pipet hoặc các dụng cụ khác.Lắc nhanh và để yên ở nhiệt độ phòng trong 3 – 5 phút.Đảm bảo mẫu hạt được ngâm trong dung dịch đệm pha loãng.Sau một thời gian ly tâm ngắn, thêm 1 μl chất nổi phía trên vào hệ thống PCR làm mẫu phản ứng.

Phương pháp ly giải nhiệt:Dùng dao mổ cắt hạt có đường kính 5 mm, thêm chúng vào 100 µl Dung dịch đệm ly giải trực tiếp thực vật A và đun nóng ở 95°C trong 5 – 10 phút.Thời gian ly giải có thể được kéo dài một cách thích hợp đối với những lá khó ly giải (không quá 30 phút).Sau khi đun nóng, ly tâm nhanh và thêm 1 µl chất nổi phía trên vào hệ thống PCR làm mẫu phản ứngb.

Một.Kéo hoặc các dụng cụ khác cũng có thể được sử dụng để cắt các mẫu có kích thước phù hợp;nếu dụng cụ đục lỗ hoặc kéo được tái sử dụng, chúng phải được làm sạch bằng dung dịch natri hypoclorit 2% trước mỗi lần sử dụng để tránh lây nhiễm chéo giữa các mẫu.

b.Đảm bảo rằng Plant Direct Lysis Buffer đã tan chảy hoàn toàn trước khi sử dụng.Nếu đệm có độ nhớt hoặc có kết tủa thì có thể đun nóng ở 37oC để làm tan chảy hoàn toàn trước khi sử dụng.

c.Thể tích mẫu trong hệ thống phản ứng có thể được điều chỉnh phù hợp tùy theo sự chênh lệch về thể tích nguyên liệu thực vật và chất pha loãng được thêm vào.

Bộ đệm ly giải trực tiếp thực vật

Dung dịch đệm ly giải trực tiếp thực vật A có trong sản phẩm này đã được tối ưu hóa nghiêm ngặt để giải phóng bộ gen của hầu hết các mô thực vật và phù hợp để bảo quản thực vật thô trong thời gian ngắn ở 4oC.Nếu mẫu cần được bảo quản trong thời gian dài hơn (ví dụ: 1 – 2 tháng), nên chuyển phần nổi phía trên sang ống EP mới và bảo quản ở -20oC.Để bảo quản mẫu ổn định hơn, thêm một thể tích tương đương Dung dịch đệm ly giải trực tiếp thực vật B vào phần nổi phía trên được chuyển, trộn đều và bảo quản ở -20oC.Thời gian bảo quản ổn định thay đổi tùy theo mẫu thực vật và trạng thái.

Hệ thống phản ứng

Một.Nó chứa Mg²⁺ở nồng độ cuối cùng là 2 mM.

b.Nên sử dụng nồng độ cuối cùng là 0,4μM cho mỗi lớp sơn lót.Việc sử dụng quá nhiều mồi sẽ dẫn đến tăng độ khuếch đại không đặc hiệu.

c.Lượng mẫu sử dụng có thể được điều chỉnh theo tình hình thực tế.Lượng sử dụng trong một phản ứng duy nhất của mẫu ly giải thô có thể được điều chỉnh trong khoảng từ 2% – 20% tổng thể tích của phản ứng.Sử dụng quá nhiều mẫu có thể gây ra lỗi khuếch đại.

Chương trình phản ứng

Một.Biến tính ban đầu (98oC, 5 phút) thúc đẩy quá trình phân giải mô thực vật, giải phóng DNA bộ gen có thể được sử dụng để khuếch đại PCR.Không rút ngắn thời gian hoặc giảm nhiệt độ.

b.Nên đặt nó bằng giá trị Tm của mồi hoặc cao hơn giá trị Tm 2 ~ 4oC.DNA polymerase khuếch đại trực tiếp được sử dụng trong sản phẩm này khác với Taq DNA polymerase thông thường và có các yêu cầu đặc biệt về nhiệt độ ủ phản ứng; việc sử dụng nhiệt độ ủ cao có thể làm giảm hiệu quả khuếch đại không đặc hiệu và cải thiện hiệu quả khuếch đại.Đối với các mẫu phức tạp, có thể đạt được khả năng khuếch đại hiệu quả bằng cách điều chỉnh nhiệt độ ủ và kéo dài thời gian kéo dài.

c.Nếu độ dài của sản phẩm khuếch đại ≤1 kb thì thời gian kéo dài được đặt ở mức 30 giây/kb;nếu độ dài của sản phẩm khuếch đại >1 kb thì thời gian kéo dài được đặt ở mức 60 giây/kb.

d.Đối với các mẫu phức tạp hoặc mẫu có hiệu suất khuếch đại thấp, số chu kỳ có thể tăng lên thích hợp lên 40 -50 chu kỳ.

Các ứng dụng

Nó có thể áp dụng để khuếch đại trực tiếp các mô thực vật và sàng lọc hiệu suất cao các mẫu thực vật không chứa polysaccharides và polyphenol.

Ghi chú

Chỉ sử dụng cho nghiên cứu.Không để sử dụng trong các thủ tục chẩn đoán.

1. Đối với khuếch đại thực vật thô hoặc khuếch đại trực tiếp, nên sử dụng DNA bộ gen tinh khiết làm đối chứng dương tính trước khi bắt đầu thí nghiệm để đảm bảo rằng hệ thống, mồi và hoạt động là chính xác.

2. DNA polymerase khuếch đại trực tiếp được sử dụng trong bộ sản phẩm này có hoạt tính hiệu đính mạnh mẽ.Nếu cần thực hiện nhân bản TA, nên tinh sạch DNA trước khi thêm adenine.

3. Hướng dẫn thiết kế sơn lót:

Một.Khuyến cáo rằng lớp nền cuối cùng ở đầu 3’ của lớp sơn lót phải là G hoặc C.

b.Cần tránh sự không khớp liên tiếp ở 8 base cuối cùng ở đầu 3’ của mồi.c.Tránh cấu trúc kẹp tóc ở đầu 3’ của lớp sơn lót.

d.Sự khác biệt về giá trị Tm của lớp sơn lót thuận và lớp sơn lót ngược không được quá 1oC và giá trị Tm phải được điều chỉnh thành 60 ~ 72oC (Nên sử dụng Primer Premier 5 để tính giá trị Tm).

đ.Không nên đưa các trình tự mồi bổ sung không khớp với mẫu vào khi tính giá trị Tm của mồi.

f.Khuyến nghị hàm lượng GC của sơn lót là 40% -60%.

g.Sự phân bố tổng thể của A, G, C và T trong lớp sơn lót phải càng đồng đều càng tốt.Tránh sử dụng các vùng có hàm lượng GC hoặc AT cao.

h.Tránh sự hiện diện của các trình tự bổ sung gồm 5 bazơ trở lên trong mồi hoặc giữa hai mồi và tránh sự hiện diện của các trình tự bổ sung gồm 3 bazơ trở lên ở đầu 3’ của hai mồi.

Tôi.Sử dụng chức năng NCBI BLAST để kiểm tra tính đặc hiệu của mồi nhằm tránh hiện tượng khuếch đại không đặc hiệu.