Proteinase K NGS (bột)
Mã số: HC4507A
NGS Protease K là một protease serine ổn định với hoạt tính enzyme cao và tính đặc hiệu cơ chất rộng. Enzyme này ưu tiên phân hủy các liên kết este và liên kết peptide gần đầu C của axit amin kỵ nước, axit amin chứa lưu huỳnh và axit amin thơm.Vì vậy, nó thường được sử dụng để phân hủy protein thành các peptide ngắn.NGS Protease K là một protease serine điển hình với Asp39-Của anh ấy69-Ser224bộ ba xúc tác duy nhất của serine protease và trung tâm xúc tác được bao quanh bởi kéo Ca2+vị trí gắn kết để ổn định, duy trì hoạt tính enzyme cao trong phạm vi điều kiện rộng hơn.
Sự chỉ rõ
| Vẻ bề ngoài | Bột vô định hình màu trắng đến trắng nhạt, đông khô |
| Hoạt động cụ thể | ≥40U/mg chất rắn |
| DNase | Không phát hiện thấy |
| RNase | Không phát hiện thấy |
| gánh nặng sinh học | 50CFU/g chất rắn |
| Dư lượng axit nucleic | <5pg/mg chất rắn |
Của cải
| Nguồn | Album tritirachium |
| số EC | 3.4.21.64(Tái tổ hợp từ album Tritirachium) |
| Trọng lượng phân tử | 29kDa (TRANG SDS) |
| Điểm đẳng điện | 7.81 Hình 1 |
| pH tối ưu | 7,0-12,0 (Tất cả đều hoạt động cao) Hình 2 |
| Nhiệt độ tối ưu | 65oC Hình 3 |
| Độ ổn định pH | pH 4,5-12,5 (25oC, 16h) Hình 4 |
| Ổn định nhiệt | Dưới 50oC (pH 8,0, 30 phút) Hình 5 |
| Độ ổn định lưu trữ | Được bảo quản ở 25oC trong 12 tháng Hình 6 |
| Trình kích hoạt | SDS, urê |
| chất ức chế | Diisopropyl fluorophosphate;benzylsulfonyl florua |
Điều kiện bảo quản
Bảo quản bột đông khô ở -25 ~ -15oC trong thời gian dài, tránh ánh sáng;Sau khi hòa tan, chia thành thể tích thích hợp để bảo quản ngắn hạn ở nhiệt độ 2-8oC, tránh ánh sáng hoặc bảo quản lâu dài ở -25~-15oC, tránh ánh sáng.
Các biện pháp phòng ngừa
Đeo găng tay và kính bảo hộ khi sử dụng hoặc cân và giữ thông gió tốt sau khi sử dụng.Sản phẩm này có thể gây phản ứng dị ứng da và kích ứng mắt nghiêm trọng.Nếu hít phải có thể gây dị ứng hoặc có triệu chứng hen suyễn hoặc khó thở.Có thể gây kích ứng đường hô hấp.
định nghĩa đơn vị
Một đơn vị NGS Protease K được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để thủy phân casein thành 1 μmol L-tyrosine trong điều kiện xác định tiêu chuẩn.
Chuẩn bị thuốc thử
| Thuốc thử | nhà chế tạo | Mục lục |
| Casein kỹ thuậttừ sữa bò | Sigma Aldrich | C7078 |
| NaOH | Hóa chất SinopharmThuốc thử Công ty TNHH | 10019762 |
| NaH2PO4·2H2O | Hóa chất SinopharmThuốc thử Công ty TNHH | 20040718 |
| Na2HPO4 | Hóa chất SinopharmThuốc thử Công ty TNHH | 20040618 |
| Axit tricloaxetic | Hóa chất SinopharmThuốc thử Công ty TNHH | 80132618 |
| Natri axetat | Hóa chất SinopharmThuốc thử Công ty TNHH | 10018818 |
| A-xít a-xê-tíc | Hóa chất SinopharmThuốc thử Công ty TNHH | 10000218 |
| HCl | Hóa chất SinopharmThuốc thử Công ty TNHH | 10011018 |
| Sô đa | Hóa chất SinopharmThuốc thử Công ty TNHH | 10019260 |
| Folin-phenol | Công nghệ sinh học Sangon (Thượng Hải)Công ty Trách Nhiệm Hữu Hạn. | A500467-0100 |
| L-tyrosine | Sigma | 93829 |
Thuốc thử I:
Cơ chất: 1% Casein từ dung dịch sữa bò: hòa tan 1g casein sữa bò trong 50ml dung dịch natri photphat 0,1M, pH 8,0, đun cách thủy ở 65-70°C trong 15 phút, khuấy đều và hòa tan, làm nguội bằng nước, điều chỉnh bằng natri hydroxit đến pH 8,0 và pha loãng thành 100ml.
Thuốc thử II:
Dung dịch TCA: Axit trichloroacetic 0,1M, natri axetat 0,2M và axit axetic 0,3M (cân lần lượt 1,64g axit trichloroacetic + 1,64g natri axetat + 1,724mL axit axetic, thêm 50mL nước khử ion, điều chỉnh bằng HCl đến pH 4,03 và pha loãng thành 100ml).
Thuốc thử III:
0,4m dung dịch natri cacbonat (cân 4,24g natri cacbonat khan hòa tan trong 100mL nước)
Thuốc thử IV:
Thuốc thử Folin phenol: pha loãng 5 lần bằng nước khử ion.
Thuốc thử V:
Dung dịch pha loãng enzyme: dung dịch natri photphat 0,1 M, pH 8,0.
Thuốc thử VI:
Dung dịch chuẩn L-tyrosine: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml L-tyrosine hòa tan với HCl 0,2M.
Thủ tục
1. Bật máy quang phổ UV-Vis và chọn phép đo trắc quang.
2. Đặt bước sóng là 660nm.
3. Bật bồn nước, đặt nhiệt độ ở mức 37oC, đảm bảo nhiệt độ không thay đổi trong 3-5 phút.
4. Làm nóng trước 0,5mL chất nền trong ống ly tâm 2mL ở bể nước 37oC trong 10 phút.
5. Chiết 0,5mL dung dịch enzyme pha loãng vào ống ly tâm đã được làm nóng trước trong 10 phút.Đặt chất pha loãng enzyme làm nhóm trống.
6. Thêm 1,0 mL thuốc thử TCA ngay sau phản ứng.Trộn đều và ủ trong nồi cách thủy trong 30 phút.
7. Ly tâm dung dịch phản ứng.
8. Thêm các thành phần sau theo thứ tự được chỉ định.
| Thuốc thử | Âm lượng |
| Chất nổi phía trên | 0,5mL |
| Natri cacbonat 0,4M | 2,5mL |
| Thuốc thử folin phenol | 0,5mL |
9. Trộn đều trước khi ủ trong nồi cách thủy ở nhiệt độ 37oC trong 30 phút.
10. OD660được xác định là OD1;nhóm chứng trống: Dung dịch pha loãng enzyme được sử dụng để thay thế dung dịch enzyme để xác định OD660như OD2, ΔOD=OD1-OD2.
11. Đường cong chuẩn L-tyrosine: 0,5mL dung dịch L-tyrosine nồng độ khác nhau, 2,5mL Natri cacbonat 0,4M, thuốc thử Folin phenol 0,5mL trong ống ly tâm 5mL, ủ trong 37oC trong 30 phút, phát hiện OD660đối với nồng độ L-tyrosine khác nhau, sau đó thu được đường chuẩn Y=kX+b, trong đó Y là nồng độ L-tyrosine, X là OD600.
Phép tính
2: Tổng thể tích dung dịch phản ứng (mL)
0,5: Thể tích dung dịch enzyme (mL)
0,5: Thể tích chất lỏng phản ứng được sử dụng trong xác định màu sắc (mL)
10: Thời gian phản ứng (phút)
Df: Pha loãng nhiều lần
C: Nồng độ enzyme (mg/mL)
Số liệu
Hình 1 dư lượng DNA
| Vật mẫu | đại lộ C4 | Axit nucleic Phục hồi (trang/mg) | Sự hồi phục(%) | Tổng hạt nhân Axit ( trang/mg) |
| PRK | 24,66 | 2,23 | 83% | 2,687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126.728 | — | — |
| STD1 | 12.955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| H2O không chứa RNA | Chưa xác định | — | — | — |
Hình 2 Độ pH tối ưu
Hình 3 Nhiệt độ tối ưu
Hình 4 Độ ổn định pH
Hình 5 Độ ổn định nhiệt
Hình 6 Độ ổn định khi bảo quản ở 25oC
