Bộ Maxi Plasmid EndoFree

Điều kiện bảo quản

RNaseA nên được bảo quản ở -30 ~ -15oC và vận chuyển ở ≤0oC.

Chất tẩy nội độc tố có thể được bảo quản ở 2 ~ 8oC trong một tháng, được bảo quản ở -30 ~ -15oC để lưu trữ lâu dàivà vận chuyển ở .00oC.

Các thành phần khác nên được bảo quản ở nhiệt độ phòng (15 ~ 25oC) và vận chuyển ở nhiệt độ phòng.

Các thành phần

RNaseA:10 mg/ml, dùng để loại bỏ RNA.

Bộ đệm P1:đệm huyền phù vi khuẩn, thêm RNaseA vào đệm P1 trước khi sử dụng lần đầu.

Bộ đệm P2:đệm ly giải vi khuẩn (có chứa SDS/NaOH).

Bộ đệm P4:đệm trung hòa.

Chất tẩy nội độc tố:loại bỏ hiệu quả nội độc tố khỏi dịch chiết plasmid thô.

Bộ đệm PW:rửa đệm, thêm lượng ethanol quy định trước khi sử dụng lần đầu.

Bộ đệm TB:đệm rửa giải.

Cột Maxi DNA FastPure:cột hấp phụ DNA plasmid.

Ống thu thập 50 ml:ống thu dịch lọc.

Ống thu thập không chứa nội độc tố:ống thu thập DNA plasmid.

Nguyên liệu đã chuẩn bị

Ethanol tuyệt đối, isopropanol, ống ly tâm đáy tròn 50 ml và 50 ml không chứa nội độc tốống ly tâm.

Các ứng dụng

Sản phẩm này phù hợp để chiết tách plasmid quy mô lớn từ 150 - 300 ml dung dịch vi khuẩnnuôi qua đêm.

Quá trình thử nghiệm

1. Lấy 150 – 200 ml (không quá 300 ml) dung dịch vi khuẩn nuôi cấy qua đêm và ly tâm ởkhoảng 11.000 vòng/phút (12.000 × g) trong 1 – 2 phút.Loại bỏ phần nổi phía trên và thu thập vi khuẩn.

Δ Khi thu thập hơn 50 ml dung dịch vi khuẩn, có thể thu thập vi khuẩn bằng cách thêm dung dịch vi khuẩn, ly tâm, loại bỏ phần nổi phía trên và các bước khác trong cùng một ống 50 ml cho

nhiều lần.

2. Thêm 7,5 ml Dung dịch đệm P1 (vui lòng kiểm tra xem RNaseA đã được thêm vào Dung dịch đệm P1 chưa) vào máy ly tâmống chứa vi khuẩn và trộn kỹ bằng vortex hoặc pipet.

Δ Việc tái huyền phù hoàn toàn vi khuẩn trong bước này là rất quan trọng để đạt được năng suất và không được có các khối vi khuẩn nào sau khi huyền phù lại.Nếu có các cụm vi khuẩn không được trộn kỹ sẽ ảnh hưởng đến quá trình ly giải, dẫn đến năng suất và độ tinh khiết thấp.Nếu OD600 của dung dịch vi khuẩn là 0,65 thì nên sử dụng 7,5 ml Dung dịch đệm P1 khi chiết từ 150 ml dung dịch vi khuẩn;khi OD600 là 0,75, nên sử dụng 8 ml Dung dịch đệm P1 và thể tích của Dung dịch đệm P2 và P4 phải được thay đổi tương ứng.Nếu thể tích dung dịch vi khuẩn tăng lên đến 200 ml thì nên sử dụngthể tích của Bộ đệm P1, P2 và P4 được tăng lên tương ứng.

3. Thêm 7,5 ml Buffer P2 vào huyền phù vi khuẩn ở bước 2 và trộn nhẹ nhàng lên xuống trong 6 – 8lần và ủ ở nhiệt độ phòng trong 4 – 5 phút.

Δ Đảo ngược nhẹ nhàng để trộn kỹ.Việc xoáy sẽ gây ra sự phân mảnh DNA bộ gen, dẫn đến các đoạn DNA bộ gen trong plasmid được chiết xuất.Lúc này, dung dịch trở nên nhớt và trong mờ chứng tỏ vi khuẩn đã bị ly giải hoàn toàn.Thời gian không quá 5 phút để tránh sự phá hủy plasmid.Nếu dung dịch không trong, có thể có quá nhiều vi khuẩn dẫn đếnly giải không hoàn toàn nên lượng vi khuẩn cần được giảm đi một cách thích hợp.

4. Thêm 7,5 ml Dung dịch đệm P4 vào huyền phù vi khuẩn từ bước 3 và đảo ngược ngay lập tức nhẹ nhàng 6 – 8 lần để dung dịch trung hòa hoàn toàn Dung dịch đệm P2.Lúc này sẽ xuất hiện kết tủa bông trắng.Ly tâm ở tốc độ hơn 11.000 vòng/phút (12.000 × g) trong 10 – 15 phút, cẩn thận hút phần nổi phía trên vào ống ly tâm đáy tròn 50 ml mới (tự chuẩn bị) và tránhhút kết tủa trắng nổi.

Δ Thêm Buffer P4 vào và đảo ngược ngay để trộn đều.Để yên ống cho đến khi kết tủa trắng phân bố đều khắp dung dịch để tránh tạo ra kết tủa cục bộ có thể ảnh hưởng đến quá trình trung hòa.Nếu không có kết tủa keo tụ màu trắng đồng nhất trước khi ly tâm và phần nổi phía trên không trong sau khi ly tâm thì ống có thể bị hỏng.ly tâm thêm 5 phút nữa.

5. Thêm 0,1 lần thể tích (10% thể tích phần nổi phía trên, khoảng 2,2 ml) Endotoxin Scavenger vào phần nổi phía trên từ bước 4 và đảo ngược để trộn.Đặt dung dịch vào bồn nước đá hoặc cho vào đá nghiền (hoặc tủ đông trong tủ lạnh) trong 5 phút cho đến khi dung dịch chuyển từ đục sang trong và trong suốt (hoặc vẫn còn).hơi đục) và thỉnh thoảng trộn vài lần.

Δ Sau khi thêm Chất khử nội độc tố vào phần nổi phía trên, phần nổi phía trên sẽ trở nên đục nhưngphần nổi phía trên sẽ trở nên trong (hoặc hơi đục) sau khi làm nguội trong bể nước đá.

6. Sau khi chất nổi phía trên được đặt ở nhiệt độ phòng (>25oC) trong 10 – 15 phút, nó sẽ trở nên đục nhưnhiệt độ của nó tăng lên đến nhiệt độ phòng.Sau đó, đảo ngược phần nổi phía trên để trộn.

Δ Nếu nhiệt độ phòng thấp hơn hoặc bạn muốn giảm thời gian chiết, phần nổi phía trên có thể được ủ trong bể nước 37 ~ 42 oC trong 5 – 10 phút và bước tiếp theo có thể được thực hiện sau phần nổi phía trêntrở nên đục.

7. Ly tâm phần nổi phía trên ở tốc độ khoảng 11.000 vòng/phút (12.000 × g) trong 10 phút ở nhiệt độ phòng (nhiệt độ phải >25oC) để tách pha.Pha nước phía trên chứa DNA trong khi lớp pha dầu màu xanh phía dưới chứa nội độc tố và các tạp chất khác.ChuyểnPha nước chứa DNA vào ống mới vàloại bỏ lớp dầu.

Δ Nhiệt độ trong quá trình ly tâm phải trên 25oC vì việc tách pha hiệu quả khôngxảy ra nếu nhiệt độ quá thấp.

Δ Nếu việc tách pha không hiệu quả, nhiệt độ ly tâm có thể được điều chỉnh thành 30oC vàthời gian ly tâm có thể tăng lên 15 phút.

Δ Không hút lớp dầu màu xanh vì nó có chứa nội độc tố và các tạp chất khác.

Cơ chế

Trung hòa ly giải huyền phù

◇ Thêm 7,5 ml dung dịch đệm P1

◇ Thêm 7,5 ml dung dịch đệm P2

◇ Thêm 7,5 ml Dung dịch đệm P4

Loại bỏ nội độc tố

◇Thêm 0,1 lần thể tích bề mặt của Endotoxin Scavenger

Ràng buộc và giặt

◇ Thêm 0,5 lần thể tích isopropanol

◇ Thêm 10 ml dung dịch đệm PW