Bộ kiểu gen chuột
Mã số: HCR2021A
Sản phẩm này là một bộ dụng cụ được thiết kế để xác định nhanh chóng các kiểu gen của chuột, bao gồm hệ thống khuếch đại PCR và chiết DNA thô.Sản phẩm có thể được sử dụng để khuếch đại PCR trực tiếp từ đuôi chuột, tai, ngón chân và các mô khác sau khi phân tách đơn giản bằng Lysis Buffer và Proteinase k.Không cần phân hủy qua đêm, chiết xuất phenol-chloroform hoặc tinh chế bằng cột, đơn giản và rút ngắn thời gian thí nghiệm.Sản phẩm phù hợp để khuếch đại các đoạn mục tiêu lên tới 2kb và phản ứng PCR đa kênh với tối đa 3 cặp mồi.Hỗn hợp PCR trực tiếp mô chuột 2× chứa DNA polymerase biến đổi gen, Mg2+, dNTP và hệ thống đệm được tối ưu hóa để mang lại hiệu quả khuếch đại cao và khả năng chịu đựng chất ức chế, nhờ đó phản ứng PCR có thể được thực hiện bằng cách thêm khuôn và mồi cũng như bù nước cho sản phẩm đến 1×.Sản phẩm PCR được khuếch đại bằng sản phẩm này có gốc “A” nổi bật ở đầu 3’ và có thể được sử dụng trực tiếp để nhân bản TA sau khi tinh chế.
Các thành phần
| Thành phần | Kích cỡ |
| Hỗn hợp PCR trực tiếp mô chuột 2× | 5 × 1,0mL |
| Đệm ly giải | 2 × 20mL |
| Proteinase K | 800μL |
Điều kiện bảo quản
Sản phẩm nên được bảo quản ở -25~-15oC trong 2 năm.Sau khi rã đông, Lysis Buffer có thể được bảo quản ở nhiệt độ 2~8oC để sử dụng nhiều lần trong thời gian ngắn và trộn đều khi sử dụng.
Ứng dụng
Sản phẩm này phù hợp để phân tích loại bỏ chuột, phát hiện biến đổi gen, kiểu gen, v.v.
Đặc trưng
1.Thao tác đơn giản: không cần trích xuất DNA bộ gen;
2.Ứng dụng rộng rãi: thích hợp để khuếch đại trực tiếp các mô chuột khác nhau.
Hướng dẫn
1.Giải phóng DNA bộ gen
1) Chuẩn bị lysate
Lysate mô được chuẩn bị theo số lượng mẫu chuột cần ly giải (lysate mô phải được chuẩn bị tại chỗ theo liều lượng và trộn kỹ để sử dụng), và tỷ lệ thuốc thử cần thiết cho một mẫu như sau:
| Các thành phần | Khối lượng (μL) |
| Proteinase K | 4 |
| Đệm ly giải | 200 |
2) Chuẩn bị và phân giải mẫu
Khuyến nghị sử dụng khăn giấy
| LoạiMô | Khối lượng đề xuất |
| Đuôi chuột | 1-3mm |
| Tai chuột | 2-5mm |
| ngón chân chuột | 1-2 miếng |
Lấy một lượng mẫu mô chuột thích hợp cho vào các ống ly tâm sạch, thêm 200μL dịch ly giải mô tươi vào mỗi ống ly tâm, lắc đều và lắc, sau đó ủ ở 55oC trong 30 phút, sau đó đun nóng ở 98oC trong 3 phút.
3) Ly tâm
Lắc đều dịch ly giải và ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong 5 phút.Chất nổi phía trên có thể được sử dụng làm khuôn cho khuếch đại PCR.Nếu cần bảo quản mẫu, hãy chuyển phần nổi phía trên sang ống ly tâm vô trùng khác và bảo quản ở -20oC trong 2 tuần.
2.Khuếch đại PCR
Lấy Hỗn hợp PCR trực tiếp mô chuột 2x ra khỏi nhiệt độ -20oC và rã đông trên đá, trộn lộn ngược và chuẩn bị hệ thống phản ứng PCR theo bảng sau (vận hành trên đá):
| Các thành phần | 25μLHệ thống | 50μLHệ thống | Nồng độ cuối cùng |
| Hỗn hợp PCR trực tiếp mô chuột 2× | 12,5μL | 25μL | 1× |
| Lớp sơn lót 1 (10μM) | 1,0μL | 2,0μL | 0,4μM |
| Lớp sơn lót 2 (10μM) | 1,0μL | 2,0μL | 0,4μM |
| sản phẩm phân cắta | Theo yêu cầu | Theo yêu cầu |
|
| ddH2O | Lên đến 25μL | Lên đến 50μL |
|
Ghi chú:
a) Lượng thêm vào không được vượt quá 1/10 của hệ thống, nếu thêm quá nhiều có thể gây ức chế quá trình khuếch đại PCR.
Điều kiện PCR được đề xuất
| Bước chu kỳ | Nhiệt độ. | Thời gian | Chu kỳ |
| Biến tính ban đầu | 94oC | 5 phút | 1 |
| Biến tính | 94oC | 30 giây | 35-40 |
| Ủa | Tm+3~5oC | 30 giây | |
| Sự mở rộng | 72oC | 30 giây/kb | |
| Phần mở rộng cuối cùng | 72oC | 5 phút | 1 |
| - | 4oC | Giữ | - |
Ghi chú:
a) Nhiệt độ ủ: Khi tham chiếu đến giá trị Tm của lớp sơn lót, nên đặt nhiệt độ ủ ở giá trị Tm nhỏ hơn của lớp sơn lót +3 ~ 5oC.
Các vấn đề và giải pháp thường gặp
1.Không có dải mục tiêu
1) Sản phẩm ly giải quá mức.Chọn số lượng mẫu phù hợp nhất, thường không quá 1/10 hệ thống;
2) Cỡ mẫu quá lớn.Pha loãng dịch ly giải 10 lần rồi khuếch đại hoặc giảm cỡ mẫu và ly giải lại;
3) Mẫu mô không còn tươi.Nên sử dụng mẫu mô tươi;
4) Chất lượng sơn lót kém.Sử dụng DNA bộ gen để khuếch đại nhằm xác minh chất lượng mồi và tối ưu hóa thiết kế mồi.
2.Khuếch đại không đặc hiệu
1) Nhiệt độ ủ quá thấp và số chu kỳ quá cao.Tăng nhiệt độ ủ và giảm số chu kỳ;
2) Nồng độ mẫu quá cao.Giảm lượng mẫu hoặc pha loãng mẫu 10 lần sau khi khuếch đại;
3) Độ đặc hiệu của mồi kém.Tối ưu hóa thiết kế lớp sơn lót.
Ghi chú
1.Để tránh nhiễm bẩn chéo giữa các mẫu, cần chuẩn bị nhiều dụng cụ lấy mẫu và bề mặt của dụng cụ có thể được làm sạch bằng dung dịch natri hypoclorit 2% hoặc chất tẩy rửa axit nucleic sau mỗi lần lấy mẫu nếu cần sử dụng nhiều lần.
2.Nên sử dụng mô chuột tươi và thể tích lấy mẫu không được quá lớn để tránh ảnh hưởng đến kết quả khuếch đại.
3.Lysis Buffer nên tránh đóng băng-tan băng thường xuyên và có thể được bảo quản ở 2 ~ 8oC để sử dụng nhiều lần trong thời gian ngắn.Nếu bảo quản ở nhiệt độ thấp, có thể xảy ra kết tủa và phải hòa tan hoàn toàn trước khi sử dụng.
4.Hỗn hợp PCR nên tránh đông lạnh-tan băng thường xuyên và có thể bảo quản ở 4oC để sử dụng nhiều lần trong thời gian ngắn.
5.Sản phẩm này chỉ dành cho nghiên cứu thực nghiệm khoa học và không nên được sử dụng trong chẩn đoán hoặc điều trị lâm sàng.
