Bộ kit mini chiết xuất DNA
Bộ này sử dụng hệ thống đệm được tối ưu hóa và công nghệ tinh chế cột silica gel, có thể phục hồi các đoạn DNA 70 bp – 20 kb từ các nồng độ gel agarose TAE hoặc TBE khác nhau.Cột hấp phụ DNA có thể hấp phụ DNA đặc biệt trong điều kiện muối cao.Ngoài ra, bộ sản phẩm có thể tinh chế trực tiếp các đoạn DNA từ sản phẩm PCR, hệ thống phản ứng enzyme hoặc sản phẩm DNA thô thu được bằng các phương pháp khác và loại bỏ các tạp chất như protein, các hợp chất hữu cơ khác, ion muối vô cơ và mồi oligonucleotide.Nó có thể đảm bảo rằng quá trình thanh lọc có thể được hoàn thành trong vòng 10-15 phút.DNA tinh khiết có thể được sử dụng trực tiếp để thắt, biến đổi, tiêu hóa enzyme, sao chép in vitro, PCR, giải trình tự, vi tiêm, v.v.
Điều kiện bảo quản
Bảo quản ở -15 ~ -25oC và vận chuyển ở nhiệt độ phòng.
Các thành phần
| Các thành phần | (100 rxn) |
| GDP đệm | 80ml |
| Bộ đệm GW | 2×20ml |
| Bộ đệm rửa giải | 20ml |
| Cột Mini FastPure DNA-G | 100 |
GDP đệm:Bộ đệm liên kết DNA.
Bộ đệm GW:Đệm rửa;thêm etanol tuyệt đối theo thể tích ghi trên chai trước khi sử dụng.
Bộ đệm rửa giải:Rửa giải.
Cột Mini FastPure DNA-G:Cột hấp phụ DNA
Ống thu thập 2 ml:Ống thu thập dịch lọc.
Nguyên liệu đã chuẩn bị
Ống tiệt trùng 1,5 ml, ethanol tuyệt đối và isopropanol (khi đoạn DNA ≤100 bp, thêm 1 thể tích
isopropanol thành 1 thể tích gel), cách thủy.
Quá trình thử nghiệm
Thêm 80 ml ethanol vào pha loãng Buffer GW như ghi trên nhãn trước khi sử dụng, bảo quản ở nhiệt độ phòng.
Cơ chế
1. Dung dịch phản ứng PCR
Sơ đồ chiết gel:Thêm thể tích bằng nhau Sơ đồ thu hồi dung dịch phản ứng PCR GDP đệm:Thêm 5 lần âm lượng Bộ đệm
2. GDP Tính khối lượng gel(100 μl bằng 100 mg)
Hòa tan gel
3. Làm nóng trước ở mức 50 ~ 55oC
4. Giặt ràng buộc
Thêm 300 µL GDP đệm*
Thêm 700 µL đệm GW
Thêm 700 µL đệm GW
5. Rửa giải
Thêm 20 – 30μL Elution Buffer hoặc nước khử ion
Lưu ý* Thu hồi dịch phản ứng PCR không cần bước này
Chương trình chiết gel
1. Sau khi điện di DNA để phân tách các đoạn DNA, cắt một dải đoạn DNA duy nhất ra khỏi gel agarose dưới ánh sáng tia cực tím.Nên sử dụng giấy thấm để hấp thụ độ ẩm biểu kiến của gel và giảm thiểu kích thước của lát gel bằng cách loại bỏ agarose dư thừa càng tốt.Cân miếng gel (không có ống ly tâm) để tính thể tích của nó: Thể tích của 100 mg miếng gel là khoảng 100 μL, giả sử mật độ là 1g/ml.
2. Thêm thể tích bằng nhau Buffer GDP, ủ ở 50~55oC trong 7-10 phút (tùy theo kích cỡ gel, điều chỉnh thời gian ủ cho đến khi gel hòa tan hoàn toàn).Đảo ngược ống 2 lần trong quá trình ủ.
Δ Việc bổ sung 1-3 khối lượng GDP đệm sẽ không ảnh hưởng đến hiệu quả phục hồi DNA.Nếu đoạn DNA cần phục hồi <100 bp, cần thêm 3 tập GDP đệm;khi miếng gel đã tan hoàn toàn, thêm 1 thể tích isopropanol vào và trộn đều rồi tiếp tục thực hiện bước tiếp theo.
3. Ly tâm nhanh để đưa mẫu xuống đáy ống, lắp FastPure DNA Mini Columns-G vào Collection Tubes 2 ml, cẩn thận chuyển dung dịch tối đa 700 µL mỗi lần
vào cột lọc, ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút (13.800 X g) trong 30-60 giây.
4. Loại bỏ dịch lọc và thêm 300 µL Buffer GDP vào cột, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút (13.800 X g) trong 30-60 giây.
5. Loại bỏ dịch lọc và thêm 700 µL Buffer GW (kiểm tra xem etanol tuyệt đối đã được thêm trước chưa!) vào cột, ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút (13.800 X g) trong 30-60 giây.
Δ Vui lòng thêm Buffer GW xung quanh thành cột hấp phụ, hoặc thêm nắp lưng Buffer GW và trộn ngược 2 – 3 lần để giúp xả sạch muối bám vào thành ống.
6. Lặp lại bước 5.
Δ Xả bằng dung dịch đệm GW hai lần có thể đảm bảo loại bỏ hoàn toàn muối và loại bỏ ảnh hưởng đến các thí nghiệm tiếp theo.
7. Loại bỏ dịch lọc và ly tâm cột trống ở tốc độ 12.000 vòng/phút (13.800 X g) trong 2 phút.
8. Đưa cột vào ống ly tâm siêu nhỏ 1,5 ml sạch, thêm 20 - 30 µL Elution Buffer vào giữa màng cột, ủ trong 2 phút, sau đó ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút (13.800 X g) trong 1 phút.Loại bỏ cột, bảo quản DNA thu được ở -20.
Δ Chuyển phần nổi phía trên của bước 8 sang cột để rửa giải lần nữa và làm nóng trước Bộ đệm rửa giải ở mức 55 (khi đoạn DNA >3 kb) có thể hữu ích để tăng hiệu quả thu hồi.
Chương trình phục hồi sản phẩm PCR
Quy trình này được áp dụng để tinh sạch các đoạn DNA từ sản phẩm PCR, hệ thống phản ứng enzym và các sản phẩm DNA thô khác (bao gồm cả DNA di truyền).Giải pháp này có thể loại bỏ hiệu quả các nucleotide, mồi, chất làm mờ mồi, phân tử muối, enzyme và các tạp chất khác.
1. Ly tâm nhanh các sản phẩm PCR, dung dịch phản ứng enzyme và các sản phẩm DNA thô khác.Ước tính thể tích của chúng bằng pipet và chuyển vào ống 1,5 ml hoặc 2 ml đã khử trùng.Thêm ddH2O cho đến khi thể tích đạt 100 µL;trong khi đối với DNA bộ gen có nồng độ cao, pha loãng đến 300 µL bằng ddH2O sẽ giúp nâng cao hiệu quả thu hồi.
2. Thêm 5 khối lượng GDP đệm, trộn kỹ bằng cách đảo ngược hoặc xoáy.Nếu đoạn DNA quan tâm> 100 bp, cần thêm 1,5 thể tích (mẫu + GDP đệm) ethanol.
3. Đưa cột trở lại ống thu, chuyển hỗn hợp vào cột, ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút (13.800 ×g) trong 30 – 60 giây.Nếu thể tích dung dịch đã hỗn hợp >700 µL thì đưa cột hấp phụ trở lại ống thu, chuyển dung dịch còn lại sang cột hấp phụ và ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút (13.800 × g) trong 30 – 60 giây.
4. Công việc tiếp theo thực hiện ở bước 5 – 8 của chương trình chiết 08-1/Gel.
Các ứng dụng
Nồng độ gel agarose TAE hoặc TBE khác nhau;Sản phẩm PCR, hệ thống phản ứng enzyme hoặc các sản phẩm DNA thô khác thu được bằng các phương pháp khác nhau.Các mảnh được phục hồi dao động từ70 bp -20 kb.
Ghi chú
Chỉ sử dụng cho nghiên cứu.Không để sử dụng trong các thủ tục chẩn đoán.
1. Thêm 80 ml ethanol vào pha loãng Buffer GW như ghi trên nhãn trước khi sử dụng, bảo quản ở nhiệt độ phòng.
2. Nếu đệm GDP dễ kết tủa khi bảo quản ở nhiệt độ thấp thì có thể đặt ở nhiệt độ phòng một thời gian trước khi sử dụng.Nếu cần, nó có thể được làm nóng trước trong nồi cách thủy 37oC cho đến khi kết tủa hòa tan hoàn toàn, sau đó có thể sử dụng sau khi trộn.
3. Đặt trước nhiệt độ nước tắm ở mức 50 ~ 55oC.
4. Trong chương trình tách chiết 08-1/Gel bước 1, việc giảm thiểu kích thước lát gel sẽ làm giảm đáng kể thời gian hòa tan và tăng hiệu quả thu hồi (DNA tuyến tính dễ bị thủy phân khi tiếp xúc liên tục ở nhiệt độ cao).Không để gel DNA tiếp xúc với tia cực tím trong thời gian dài vì tia cực tím có thể gây tổn thương DNA.
5. Hòa tan hoàn toàn gel trong 08-1/Chương trình chiết gel bước 2, nếu không hiệu quả thu hồi DNA sẽ bị ảnh hưởng nghiêm trọng.
6. Làm nóng trước bộ đệm rửa giải hoặc ddH2O đến 55oC, rất hữu ích để cải thiện hiệu quả rửa giải DNA.Nên bảo quản DNA trong dung dịch rửa giải Tris-HCl 2,5 mM, pH 7,0 – 8,5.
