Phiên mã ngược M-MLV
RevScript Reverse Transcriptase thu được bằng công nghệ kỹ thuật di truyền.Nó có khả năng tổng hợp cDNA cao hơn, độ ổn định nhiệt và giới hạn nhiệt độ phản ứng (lên tới 60°C).Sản phẩm cDNA tổng hợp được có kích thước lên tới 10 kb.Nó tăng cường ái lực của các mẫu và phù hợp để sao chép ngược các mẫu RNA có cấu trúc thứ cấp phức tạp hoặc các gen có khả năng sao chép thấp.
Các thành phần
| Thành phần | HC2003B (10.000U) | HC2003B (5*10.000U) | HC2003B (200.000U) |
| RevScript Reverse Transcriptase (200U/μL) | 50 µL | 5×50 µL | 1mL |
| Bộ đệm RevScript 5 × | 250 µL | 1,25mL | 5mL |
Điều kiện lưu trữ
Sản phẩm này nên được bảo quản ở -25°C~-15°C trong 2 năm.
Định nghĩa đơn vị
Một đơn vị kết hợp 1nmol dTTP vào vật liệu không tan trong axit trong 10 phút ở 37°C bằng cách sử dụng Oligo(dT) làm lớp lót.
Thiết lập phản ứng
1.Biến tính mẫu RNA (Bước này là tùy chọn, biến tính mẫu RNA giúp mở các cấu trúc thứ cấp, điều này sẽ cải thiện hiệu suất của chuỗi cDNA đầu tiên.)
| Các thành phần | Âm lượng (μL) |
| ddH miễn phí RNase2O | Đến 13 |
| Oligo(dT)18 (50 mol/L) hoặc Sơn lót ngẫu nhiên (50 μmol/L) Hoặc mồi đặc hiệu gen (2 μmol/L) | 1 |
| hoặc 1 | |
| hoặc 1 | |
| mẫu ARN | X a |
Ghi chú:
1) a: RNA tổng số: 1-5 ug hoặc mRNA: 1-500 ng
2) Ủ ở 65°C trong 5 phút, sau đó chuyển ngay trên đá để làm lạnh trong 2 phút.Ly tâm nhanh để thu chất lỏng phản ứng, thêm dung dịch phản ứng sao chép ngược như trong bảng sau.Nhẹ nhàng pipet để trộn.
1.Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng (thể tích 20 µL)
| Các thành phần | Âm lượng (μL) |
| Hỗn hợp của bước trước | 13 |
| Bộ đệm 5× | 4 |
| Hỗn hợp dNTP (10nmol/L) | 1 |
| Enzyme phiên mã ngược (200 U/μL) | 1 |
| Chất ức chế RNase (40 U/μL) | 1 |
1.Thực hiện phản ứng ở điều kiện sau:
| Nhiệt độ (°C) | Thời gian |
| 25°Ca | 5 phút |
| 42°Cb | 15-30 phút |
| 85°Cc | 5 phút |
Ghi chú:
1) a.Chỉ cần ủ ở 25°C trong 5 phút khi sử dụng các hexamer ngẫu nhiên.Vui lòng bỏ qua bước này khi sử dụng Oligo (dT)18hoặc Primer đặc hiệu gen.
2) b.Nhiệt độ sao chép ngược được khuyến nghị là 42°C. Đối với các mẫu có cấu trúc bậc hai phức tạp hoặc hàm lượng GC cao, nên tăng nhiệt độ phản ứng lên 50-55°C.
3) c.Đun nóng ở 85°C trong 5 phút để vô hiệu hóa enzyme phiên mã ngược.
4) Sản phẩm có thể được sử dụng trực tiếp trong phản ứng PCR hoặc qPCR hoặc bảo quản ở -20°C để bảo quản trong thời gian ngắn.Nên phân chia sản phẩm và bảo quản ở -80°C để bảo quản lâu dài.Tránh đóng băng-tan băng thường xuyên.
5) Sản phẩm phù hợp với RT-qPCR một bước, nên thêm 10-20 U sao chép ngược cho mỗi hệ thống phản ứng 25μL hoặc tăng dần lượng enzyme sao chép ngược tùy theo tình hình thực tế.
Ghi chú
1.Hãy giữ khu vực thí nghiệm sạch sẽ;Nên đeo găng tay và khẩu trang sạch trong quá trình vận hành.Tất cả các vật tư tiêu hao được sử dụng trong thí nghiệm phải không chứa RNase để ngăn ngừa ô nhiễm RNase.
2.Tất cả các quy trình nên được thực hiện trên băng để ngăn chặn sự thoái hóa RNA.
3.Nên sử dụng các mẫu RNA chất lượng cao để đảm bảo hiệu quả sao chép ngược cao.
4.Sản phẩm này là dành cho chỉ sử dụng nghiên cứu.
5.Vui lòng sử dụng áo khoác phòng thí nghiệm và găng tay dùng một lần để đảm bảo an toàn cho bạn.
