Phiên mã ngược M-MLV Neoscript
Neoscript Reverse Transcriptase là một enzyme phiên mã ngược thu được bằng cách sàng lọc đột biến gen M-MLV của nguồn gốc và biểu hiện của virus gây bệnh bạch cầu ở chuột Moloney ở E.coli.Enzyme loại bỏ hoạt động RNase H, có khả năng chịu nhiệt độ cao hơn và thích hợp cho quá trình sao chép ngược ở nhiệt độ cao.Do đó, nó rất hữu ích trong việc loại bỏ các tác động bất lợi của cấu trúc cấp cao RNA và các yếu tố không đặc hiệu đối với quá trình tổng hợp cDNA, đồng thời có độ ổn định cao hơn và khả năng tổng hợp phiên mã ngược.Enzim có độ ổn định cao hơn và khả năng tổng hợp phiên mã ngược.
Các thành phần
1.Phiên mã ngược Neoscript 200 U/μL
2.Bộ đệm sợi đầu tiên 5 × (tùy chọn)
* 5 × First-Strand Buffer không chứa dNTP, vui lòng thêm dNTP khi chuẩn bị hệ thống phản ứng
Ứng dụng được đề xuất
1.qRT-PCR một bước.
2.Phát hiện virus RNA
Điều kiện lưu trữ
-20°C để bảo quản lâu dài, nên trộn đều trước khi sử dụng, tránh đông-rã đông thường xuyên.
Định nghĩa đơn vị
Một đơn vị kết hợp 1nmol dTTP trong 10 phút ở 37°C bằng cách sử dụng poly(A)·oligo(dT)25làm mẫu/mồi.
Kiểm soát chất lượng
1.Độ tinh khiết điện di SDS-PAGE lớn hơn 98%.
2.Độ nhạy khuếch đại, kiểm soát hàng loạt, độ ổn định.
3.Không có hoạt động nuclease ngoại sinh, không có ô nhiễm endnuclease hoặc exonuclease ngoại sinh
Thiết lập phản ứng cho giải pháp phản ứng dây chuyền đầu tiên
1.Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng
| Các thành phần | Âm lượng |
| Oligo(dT)12-18 Lót hoặc Sơn lót ngẫu nhiênMột Hoặc mồi đặc hiệu genb | 50 giờ chiều |
| 50 giờ chiều (20-100 giờ chiều) | |
| 2 giờ chiều | |
| 10 mM dNTP | 1 µL |
| RNA mẫu | Tổng RNA< 5μg;mARN< 1µg |
| dH không có RNase2O | Đến 10 µL |
Ghi chú:a/b: Vui lòng chọn các loại mồi khác nhau tùy theo nhu cầu thử nghiệm của bạn.
2.Đun nóng ở 65°C trong 5 phút và làm nguội nhanh trên đá trong 2 phút.
3.Thêm các thành phần sau vào hệ thống trên với tổng thể tích 20µL và trộn nhẹ nhàng:
| Các thành phần | Âm lượng (μL) |
| Bộ đệm sợi đầu tiên 5 × | 4 |
| Neoscript Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 1 |
| Chất ức chế RNase (40 U/μL) | 1 |
| dH không có RNase2O | Đến 20 µL |
4. Hãy thực hiện phản ứng theo các điều kiện sau:
(1) Nếu sử dụng Random Primer, phản ứng phải được thực hiện ở 25oC trong 10 phút và sau đó ở 50oC trong 30 ~ 60 phút;
(2) Nếu sử dụng Oligo dT hoặc mồi cụ thể, phản ứng phải được thực hiện ở 50oC trong 30 ~ 60 phút.
5.Đun nóng ở 95oC trong 5 phút để vô hiệu hóa Neoscript Reverse Transcriptase và chấm dứt phản ứng.
6.Các sản phẩm sao chép ngược có thể được sử dụng trực tiếp trong phản ứng PCR và phản ứng PCR định lượng huỳnh quang hoặc được bảo quản ở -20oC trong thời gian dài.
PCR Rphản ứng:
1.Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng
| Các thành phần | Sự tập trung |
| Bộ đệm PCR 10 × (không chứa dNTP, không chứa Mg²+) | 1× |
| dNTP (10mM mỗi dNTP) | 200 M |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq DNA Polymerase (5U/μL) | 2-2,5 U |
| Lớp sơn lót 1 (10 M) | 0,2-1 μM |
| Lớp sơn lót 2 (10 M) | 0,2-1 μM |
| Bản mẫuMột | 10% Dung dịch phản ứng dây chuyền đầu tiên (2 μL) |
| ddH2O | Đến 50 µL |
Ghi chú:a: Nếu thêm quá nhiều dung dịch phản ứng dây chuyền đầu tiên vào, phản ứng PCR có thể bị ức chế.
2.Quy trình phản ứng PCR
| Bước chân | Nhiệt độ | Thời gian | Chu kỳ |
| Tiền biến tính | 95oC | 2-5 phút | 1 |
| Biến tính | 95oC | 10-20 giây | 30-40 |
| Ủ | 50-60oC | 10-30 giây | |
| Sự mở rộng | 72oC | 10-60 giây |
Ghi chú
1.Thích hợp để tối ưu hóa nhiệt độ sao chép ngược trong khoảng 42oC ~ 55oC.
2.Nó có độ ổn định tốt hơn, phù hợp cho khuếch đại sao chép ngược ở nhiệt độ cao.Ngoài ra, nó thuận lợi cho việc đi qua các vùng cấu trúc phức tạp của RNA một cách hiệu quả.Ngoài ra, nóphù hợp để phát hiện RT-PCR định lượng huỳnh quang ghép kênh một bước.
3.Khả năng tương thích tốt với các enzyme khuếch đại PCR khác nhau và phù hợp với các phản ứng RT-PCR có độ nhạy cao.
4.Thích hợp cho phản ứng RT-PCR định lượng huỳnh quang một bước có độ nhạy cao, cải thiện hiệu quả tốc độ phát hiện mẫu có nồng độ thấp.
5.Thích hợp cho việc xây dựng thư viện cDNA.
