Uracil DNA Glycosylase
Uracil-DNA Glycosylase (UNG hoặc UDG) là bản sao tái tổ hợp của E.coli có trọng lượng phân tử 25 kDa.Nó xúc tác giải phóng uracil tự do từ DNA chuỗi đơn và chuỗi kép chứa uracil, đồng thời không có hoạt tính chống lại RNA và có thể được sử dụng để ngăn ngừa ô nhiễm các sản phẩm khuếch đại PCR.Nguyên lý hoạt động dựa trên thực tế là nếu dUTP được thay thế cho dTTP trong phản ứng PCR và tạo thành sản phẩm khuếch đại PCR chứa bazơ dU thì enzyme có thể phá vỡ một cách có chọn lọc liên kết glycosid của các bazơ U ở dạng mạch đơn và mạch kép. DNA và làm suy giảm sản phẩm khuếch đại PCR.
Ứng dụng được đề xuất
Khuếch đại ngăn ngừa ô nhiễm
Điều kiện lưu trữ
-20°C để bảo quản lâu dài, nên trộn đều trước khi sử dụng, tránh đông-rã đông thường xuyên.
Bộ đệm lưu trữ
20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, Chất ổn định, 50% Glycerol.
Định nghĩa đơn vị
Lượng enzyme cần thiết để phân hủy 1µg DNA chuỗi đơn chứa dU base trong 1 giờ ở 37°C là 1 đơn vị.
Kiểm soát chất lượng
1.Độ tinh khiết điện di SDS-PAGE lớn hơn 98%
2.Độ nhạy khuếch đại, kiểm soát hàng loạt, độ ổn định
3.Sau khi 1U UNG được xử lý ở 50oC trong 2 phút, mẫu chứa U dưới 103 bản sao sẽ bị phân hủy hoàn toàn và không thể tạo ra sản phẩm khuếch đại nào
4.Không có hoạt động nuclease ngoại sinh
Hướng dẫn
| Các thành phần | Khối lượng (μL) | Nồng độ cuối cùng |
| Bộ đệm PCR 10 × (không chứa dNTP, Mg²+miễn phí) | 5 | 1× |
| dUTP (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 M |
| dUTP (thay thế dTTP) | - | 200-600 MM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 µL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0,25 | 1,25 U |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| Hỗn hợp sơn lót 25 ×Một | 2 | 1× |
| Bản mẫu | - | ＜1μg/phản ứng |
| ddH₂O | Đến 50 | - |
Ghi chú: a: Nếu được sử dụng cho qPCR/qRT-PCR, nên thêm đầu dò huỳnh quang vào hệ thống phản ứng.Thông thường, nồng độ mồi cuối cùng là 0,2 μM có thể cho kết quả tốt;khi hiệu suất phản ứng kém, nồng độ mồi có thể được điều chỉnh trong khoảng 0,2-1 μM.Thông thường, nồng độ đầu dò được tối ưu hóa trong khoảng 0,1-0,3 μM.Các thí nghiệm gradient nồng độ có thể được thực hiện để tìm ra sự kết hợp tốt nhất giữa mồi và đầu dò.
Ghi chú
1.Enzym UNG có thể được sử dụng để loại bỏ các sản phẩm khuếch đại dUTP bị ô nhiễm khỏi hệ thống phản ứng trước phản ứng khuếch đại PCR, sau đó để tránh kết quả dương tính giả do nhiễm bẩn sản phẩm.
2.Nhiệt độ tối ưu để sử dụng enzyme UNG trong phản ứng PCR chống nhiễm bẩn thường là 50oC trong 2 phút;điều kiện bất hoạt là 95oC trong 5 phút.
3.Tránh đóng băng-tan băng thường xuyên và không tiếp xúc với biến động nhiệt độ lớn.
4.Các gen được khuếch đại khác nhau có hiệu suất sử dụng dUTP và độ nhạy với enzyme UNG khác nhau, do đó, nếu việc sử dụng hệ thống UNG dẫn đến giảm độ nhạy phát hiện thì hệ thống phản ứng cần được điều chỉnh và tối ưu hóa, nếu bạn cần hỗ trợ kỹ thuật, vui lòng liên hệ Công ty của chúng tôi.
