Enzyme ngăn chặn virus Vaccinia
Enzim đóng nắp virus Vaccinia có nguồn gốc từ chủng E. coli tái tổ hợp mang gen mã hóa enzyme đóng nắp Vaccinia.Enzym đơn này bao gồm hai tiểu đơn vị (D1 và D12) và có ba hoạt động enzyme (RNA triphosphatase và guanylyltransferase của tiểu đơn vị D1 và guanine methyltransferase của tiểu đơn vị D12).Enzym đóng nắp của virus Vaccinia có hiệu quả trong việc xúc tác sự hình thành cấu trúc nắp, cấu trúc này có thể gắn đặc biệt cấu trúc nắp 7-methylguanylate (m7Gppp, Cap 0) vào đầu 5’ của RNA.Cấu trúc nắp (Cap 0) đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định, vận chuyển và dịch mã mRNA ở sinh vật nhân chuẩn.Việc gắn RNA bằng phản ứng enzyme là một phương pháp hiệu quả và đơn giản, có thể cải thiện đáng kể tính ổn định và dịch mã của RNA để sao chép, chuyển nhiễm và vi tiêm in vitro.
Các thành phần
Enzyme khống chế virus Vaccinia (10 U/μL)
Bộ đệm giới hạn 10 ×
Điều kiện bảo quản
-25～- 15oC để bảo quản （Tránh chu trình đóng băng-tan băng lặp đi lặp lại）
Bộ đệm lưu trữ
20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl,
1mM DTT, 0,1mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 50% glycerol.
Định nghĩa đơn vị
Một đơn vị Enzyme đóng nắp virus Vaccinia được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để kết hợp 10pmol GTP thành bản phiên mã 80nt trong 1 giờ ở 37°C.
Kiểm soát chất lượng
Exonuclease:10U Enzyme giới hạn virus Vaccinia với 1μg DNA tiêu hóa λ-Hind III ở 37oC trong 16 giờ không mang lại sự phân hủy như được xác định bằng phương pháp điện di trên gel agarose.
Endonuclease:10U Enzyme giới hạn virus Vaccinia với 1μg λDNA ở 37oC trong 16 giờ không mang lại sự phân hủy như được xác định bằng phương pháp điện di trên gel agarose.
Nickase:10U Enzyme giới hạn virus Vaccinia với 1 μg pBR322 ở 37oC trong 16 giờ không mang lại sự phân hủy như được xác định bằng phương pháp điện di trên gel agarose.
RNase:10U Enzyme giới hạn virus Vaccinia với 1,6μg MS2 RNA trong 4 giờ ở 37oC không mang lại sự phân hủy như được xác định bằng điện di trên gel agarose.
1.coli ADN:10U của Enzyme giới hạn virus Vaccinia được sàng lọc sự hiện diện của DNA bộ gen của E. coli bằng cách sử dụng TaqMan qPCR với các đoạn mồi dành riêng cho locus E. coli 16S rRNA.Sự ô nhiễm DNA bộ gen của E. coli là 1 bộ gen của E. coli.
2.vi khuẩn Nội độc tố: Thử nghiệm LAL, theo Phiên bản Dược điển Trung Quốc IV 2020, phương pháp thử nghiệm giới hạn gel, quy tắc chung (1143).Hàm lượng nội độc tố vi khuẩn phải ≤10 EU/mg.
Hệ thống phản ứng và điều kiện
1. Giao thức giới hạn (thể tích phản ứng: 20 μL)
Quy trình này có thể áp dụng cho phản ứng giới hạn 10μg RNA ( ≥100 nt) và có thể mở rộng quy mô theo nhu cầu thử nghiệm.
I) Kết hợp 10μg RNA và H2O không chứa Nuclease trong ống vi lọc 1,5 ml đến thể tích cuối cùng là 15,0 µL.*10×Bộ đệm giới hạn: 0,5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25oC, pH 8,0)
2) Đun nóng ở 65oC trong 5 phút, sau đó ngâm trong nước đá trong 5 phút.
3) Thêm các thành phần sau theo thứ tự được chỉ định
| Cthành phần | Vdầu ô liu |
| RNA bị biến tính (<10μg, chiều dài>100 nt) | 15 µL |
| Bộ đệm giới hạn 10×* | 2 µL |
| GTP (10 mM) | 1 µL |
| SAM (2 mM) | 1 µL |
| Enzyme giới hạn vi rút bệnh đậu mùa (10U/μL) | 1 µL |
*10×Bộ đệm giới hạn: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25oC, pH8,0)
4) Ủ ở 37°C trong 30 phút, RNA hiện đã được đậy nắp và sẵn sàng cho các ứng dụng tiếp theo.
2. Thiết bị đầu cuối 5′ phản ứng dán nhãn (khối lượng phản ứng: 20 μL)
Quy trình này được thiết kế để dán nhãn RNA chứa 5' triphosphate và có thể mở rộng quy mô theo nhu cầu.Hiệu quả của việc kết hợp nhãn sẽ bị ảnh hưởng bởi tỷ lệ mol của RNA:GTP, cũng như hàm lượng GTP trong các mẫu RNA.
1) Kết hợp lượng RNA thích hợp và H2O không chứa Nuclease trong ống vi lọc 1,5 ml đến thể tích cuối cùng là 14,0 µL.
2) Đun nóng ở 65oC trong 5 phút, sau đó ngâm trong nước đá trong 5 phút.
3) Thêm các thành phần sau theo thứ tự được chỉ định.
| Cthành phần | Vdầu ô liu |
| RNA bị biến tính | 14 µL |
| Bộ đệm giới hạn 10 × | 2 µL |
| Hỗn hợp GTP** | 2 µL |
| SAM (2 mM) | 1 µL |
| Enzyme giới hạn vi rút bệnh đậu mùa (10U/μL) | 1 µL |
** GTP MIX đề cập đến GTP và một số ít điểm đánh dấu.Để biết nồng độ GTP, hãy tham khảođến Note 3.
4) Ủ ở 37°C trong 30 phút, đầu RNA 5′ bây giờ đã được dán nhãn và sẵn sàng cho quá trình tiếp theo
Các ứng dụng
1. Gắn nắp mRNA trước khi thử nghiệm dịch mã/dịch mã in vitro
2. Đánh dấu đầu 5' của mRNA
Lưu ý khi sử dụng
1.Làm nóng dung dịch RNA trước khi ủ bằng Enzyme Vaccinia Capping sẽ loại bỏ cấu trúc thứ cấp ở đầu 5'end của bản phiên mã.Kéo dài thời gian lên 60 phút đối với những bản ghi có phần 5 có cấu trúc cao đã biết.
2. RNA được sử dụng cho phản ứng đóng nắp phải được tinh chế trước khi sử dụng và lơ lửng trong nước không có nuclease.EDTA không được có mặt và dung dịch không được chứa muối.
3. Để đánh dấu đầu 5', tổng nồng độ GTP phải gấp khoảng 1-3 lần nồng độ mol của mRNA trong phản ứng.
4. Thể tích của hệ thống phản ứng có thể tăng hoặc giảm tùy theo thực tế.
