PNGase F
Peptide-N-Glycosidase F (PNGase F) là phương pháp enzyme hiệu quả nhất để loại bỏ gần như tất cả các oligosacarit liên kết N khỏi glycoprotein.PNGase F là một amidase, nó phân cắt giữa phần lớn GlcNAc và asparagine bên trong của mannose cao, lai và oligosacarit phức tạp từ glycoprotein liên kết với N.
Ứng dụng
Enzyme này rất hữu ích cho việc loại bỏ dư lượng carbohydrate khỏi protein.
Chuẩn bị và đặc điểm kỹ thuật
| Vẻ bề ngoài | Chất lỏng không màu |
| Độ tinh khiết của protein | ≥95% (từ TRANG SDS) |
| Hoạt động | ≥500.000 U/mL |
| Exoglycosidase | Không thể phát hiện hoạt động nào (ND) |
| Endoglycosidase F1 | ND |
| Endoglycosidase F2 | ND |
| Endoglycosidase F3 | ND |
| Endoglycosidase H | ND |
| Protease | ND |
Của cải
| số EC | 3.5.1.52(Tái tổ hợp từ vi sinh vật) |
| Trọng lượng phân tử | 35 kDa (TRANG SDS) |
| Điểm đẳng điện | 8. 14 |
| pH tối ưu | 7,0-8,0 |
| Nhiệt độ tối ưu | 65°C |
| Tính đặc hiệu của chất nền | Cắt liên kết glycosid giữa GlcNAc và dư lượng asparagine Hình 1 |
| Trang web công nhận | Glycans liên kết N trừ khi chứa fucose α1-3 Hình 2 |
| Trình kích hoạt | DTT |
| chất ức chế | SDS |
| Nhiệt độ bảo quản | -25 ~-15oC |
| Bất hoạt nhiệt | Hỗn hợp phản ứng 20µL chứa 1µL PNGase F bị bất hoạt bằng cách ủ ở 75°C trong 10 phút. |
Hình 1. Tính đặc hiệu cơ chất của PNGase F
Hình 2 Sự công nhận nằm ở PNGase F.
Khi dư lượng GlcNAc bên trong được liên kết với fucose α1-3, PNGase F không thể tách oligosacarit liên kết N khỏi glycoprotein.Sự biến đổi này phổ biến ở thực vật và một số glycoprotein côn trùng.
Cthành phần
|
| Các thành phần | Sự tập trung |
| 1 | PNGase F | 50 µl |
| 2 | Bộ đệm biến tính Glycoprotein 10 × | 1000 µl |
| 3 | 10×GlycoBuffer 2 | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
định nghĩa đơn vị
Một đơn vị (U) được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để loại bỏ >95% carbohydrate khỏi 10 µg RNase B biến tính trong 1 giờ ở 37°C trong tổng thể tích phản ứng là 10 µL.
Điều kiện phản ứng
1. Hòa tan 1-20 µg glycoprotein với nước khử ion, thêm 1 µl 10×Glycoprotein Denaturing Buffer và H2O (nếu cần) để tạo thành tổng thể tích phản ứng là 10 µl.
2.Ủ ở 100°C trong 10 phút, làm nguội trên đá.
3.Thêm 2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 và trộn.
4.Thêm 1-2 µl PNGase F và H2O (nếu cần) để tạo tổng thể tích phản ứng là 20 µl và trộn.
5.Ủ phản ứng ở 37°C trong 60 phút.
6.Để phân tích SDS-PAGE hoặc phân tích HPLC.
