mRNA Cap2'-O-Methyltransferase
mRNA Cap 2′ -O-methyltransferase có nguồn gốc từ chủng E. coli tái tổ hợp mang gen mã hóa vắc xin mRNA Cap 2 `-O-Methyltransferase.Enzim này thêm một nhóm metyl ở vị trí 2’-O của nucleotide đầu tiên liền kề với cấu trúc nắp ở đầu 5’ của RNA. Enzim này sử dụng S-adenosylmethionine (SAM) làm chất cho metyl cho RNA có nắp methyl (nắp -0) dẫn đến cấu trúc cap-1.
Cấu trúc Cap1 có thể tăng hiệu quả dịch mã, cải thiện sự biểu hiện của mRNA trong các thí nghiệm chuyển nhiễm và vi tiêm. Enzyme này đặc biệt yêu cầu RNA có nắp m7GpppN làm cơ chất.Nó không thể sử dụng RNA với pN, ppN, pppN hoặc GpppN ở đầu 5'.RNA bị đóng nắp có thể được điều chế thông qua phiên mã in vitro bằng cách sử dụng chất tương tự nắp hoặc thông qua việc đóng nắp bằng enzyme bằng cách sử dụng Enzyme đóng nắp Vaccinia.
Các thành phần
mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase (50U/μL)
Bộ đệm phản ứng giới hạn 10 ×
Kho
-25 ～- 15oC để bảo quản （Tránh chu trình đóng băng-tan băng lặp đi lặp lại）
Bộ đệm lưu trữ
20 mM Tris-HCl（pH 8,0,25oC), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0,1% Triton X- 100, 50% glycerol.
định nghĩa đơn vị
Một đơn vị được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để methyl hóa 10 pmole của bản phiên mã RNA có trọng lượng 80 nt trong 1 giờ ở 37°C.
Xét nghiệm kiểm soát chất lượng
Exonuclease:50U của mRNA Cap 2 ` -O-Methyltransferase với 1μg λ-Hind III DNA tiêu hóa ở 37 oC trong 16 giờ không mang lại sự phân hủy như được xác định bằng phương pháp điện di trên gel agarose.
Endonuclease: 50 U của mRNA Cap 2 ` -O-Methyltransferase với 1 μg λDNA ở 37oC trong 16 giờ không mang lại sự phân hủy như được xác định bằng phương pháp điện di trên gel agarose.
biệt danh: 50U mRNA Cap 2 ` -O-Methyltransferase với 1μg pBR322 ở 37 oC trong 16 giờ không mang lại sự phân hủy như được xác định bằng phương pháp điện di trên gel agarose.
RNase: 50U mRNA Cap 2 ` -O-Methyltransferase với 1,6μg MS2 RNA trong 4 giờ ở 37oC không tạo ra sự phân hủy như được xác định bằng phương pháp điện di trên gel agarose.
E. coli ADN: 50U của mRNA Cap 2 ` -O-Methyltransferase được kiểm tra sự hiện diện củaE. coli DNA bộ gen sử dụng TaqMan qPCR với các đoạn mồi dành riêng choE. coli Vị trí 16S rRNA.CácE. coli ô nhiễm DNA bộ gen là = 1E. coli bộ gen.
vi khuẩn nội độc tố: Thử nghiệm LAL, theo Phiên bản Dược điển Trung Quốc IV 2020, phương pháp thử nghiệm giới hạn gel, quy tắc chung (1143).Hàm lượng nội độc tố vi khuẩn phải = 10 EU/mg.
Hệ thống phản ứng và điều kiện
1. Kết hợp một lượng thích hợp Capped RNA và H2O không chứa RNase trong ống vi lọc 1,5 mL đến thể tích cuối cùng là 16,0 µL.
2. Đun nóng ở 65oC trong 5 phút, sau đó ngâm trong nước đá trong 5 phút.
3. Thêm các thành phần sau theo thứ tự đã chỉ định (đối với quá trình methyl hóa RNA bị khóa
ít hơn 10
| Thành phần | Âm lượng |
| RNA bị biến tính | 16 µL |
| Bộ đệm phản ứng giới hạn 10X* | 2 µL |
| SAM (4 mM) | 1 µL |
| mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase (50 U/μL) | 1 µL |
| ddH2O | Đến 20 µL |
*10× Dung dịch đệm phản ứng giới hạn: 500 mM Tris-HCl(pH 8,0, 25°C), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.
4. Ủ ở 37oC trong 1 giờ (nên ủ 2 giờ đối với mảnh mục tiêu dưới 200 nt).
Các ứng dụng
Để cải thiện biểu hiện mRNA trong các thí nghiệm vi tiêm và truyền máu.
Lưu ý khi sử dụng
1. Trước khi phản ứng, RNA phải được tinh chế và hòa tan trong nước không có nuclease, tất cả các dung dịch không được chứa bất kỳ EDTA và ion nào.
2. Nên làm nóng RNA mẫu ở 65oC trong 5 phút trước phản ứng để loại bỏ cấu trúc thứ cấp ở đầu 5'end của bản phiên mã.Nó có thể được kéo dài đến 10 phút đối với cấu trúc đầu cuối 5' phức tạp.
