BỘ ELISA ELISA sợi đôi (dsRNA)

Bộ sản phẩm này là một Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (ELISA) kết hợp với hệ thống biotin-Streptavidin, để đo định lượng DSRNA có chiều dài trên 60 cặp bazơ (bp), bất kể trình tự.Tấm này đã được phủ sẵn kháng thể kháng DSRNA.DSRNA có trong mẫu được thêm vào và liên kết với các kháng thể được phủ trên giếng.Sau đó, kháng thể kháng DSRNA được đánh dấu biotin được thêm vào và liên kết với DSRNA trong mẫu.Sau khi rửa, HRP-Streptavidin được thêm vào và liên kết với kháng thể kháng DSRNA Biotatin hóa.Sau khi ủ HRP-Streptavidin không liên kết sẽ bị cuốn trôi.Sau đó, dung dịch cơ chất TMB được thêm vào và được xúc tác bởi HRP để tạo ra sản phẩm có màu xanh lam chuyển sang màu vàng sau khi thêm dung dịch dừng axit.Mật độ màu vàng tỷ lệ thuận với lượng DSRNA mục tiêu được thu giữ trong đĩa.Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 450 nm.

Ứng dụng

Bộ này dùng để đo định lượng DSRNA dư.

Bộ linh kiện

Lưu trữ và ổn định

1. Đối với bộ sản phẩm chưa sử dụng: Toàn bộ bộ sản phẩm có thể được bảo quản ở nhiệt độ 2 ~ 8oC trong thời hạn sử dụng.Nên tránh ánh sáng mạnh để bảo quản ổn định.

2. Đối với bộ dụng cụ đã qua sử dụng: Sau khi mở đĩa vi mô, vui lòng đậy kín các giếng chưa sử dụng bằng chất bịt kín đĩa và trả lại túi giấy bạc chứa gói hút ẩm, dán kín túi giấy bạc và quay trở lại 2 ~ 8oC càng sớm càng tốt sau khi sử dụng.Các thuốc thử khác nên được đưa trở lại 2 ~ 8oC càng sớm càng tốt sau khi sử dụng.

Vật liệu cần thiết nhưng không được cung cấp

1. Đầu đọc vi bản với bộ lọc 450±10nm (tốt hơn nếu có thể phát hiện ở bước sóng 450 và 650 nm).

2. Máy lắc vi đĩa.

3. Đầu tip và ống ly tâm không chứa RNase.

Sơ đồ hoạt động

Trước khi bắt đầu

1. Đưa tất cả các thành phần và mẫu của bộ kit về nhiệt độ phòng (18-25oC) trước khi sử dụng.Nếu bộ sản phẩm không được sử dụng hết trong một lần, vui lòng chỉ lấy các dải và thuốc thử cho thí nghiệm hiện tại ra, đồng thời để các dải và thuốc thử còn lại trong tình trạng cần thiết.

2. Dung dịch đệm rửa: pha loãng 40mL dung dịch đệm rửa đậm đặc 20× với 760mL nước khử ion hoặc nước cất để chuẩn bị 800mL dung dịch đệm rửa 1×.

3. Tiêu chuẩn: quay nhanh hoặc ly tâm dung dịch gốc trước khi sử dụng.Nồng độ của bốn chuẩn được cung cấp là 5ng/μL.Đối với chuẩn UTP và pUTP DSRNA, vui lòng pha loãng dung dịch gốc thành 1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312,0,0156,0pg/μL với dung dịch đệm STE để vẽ đường chuẩn.Đối với chuẩn N1-Me-pUTP dsRNA, vui lòng pha loãng dung dịch gốc thành 2,1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312, 0pg/μL với dung dịch đệm STE để vẽ đường chuẩn.Đối với chuẩn 5-OMe-UTP dsRNA, vui lòng pha loãng dung dịch gốc thành 4,2,1,0,5, 0,25,0,125,0,0625, 0pg/μL bằng đệm STE để vẽ đường cong chuẩn.Chúng tôi khuyến nghị có thể pha loãng tiêu chuẩn như biểu đồ sau:

4. Kháng thể phát hiện biotin hóa và dung dịch làm việc HRP-streptavidin: quay nhanh hoặc ly tâm dung dịch gốc trước khi sử dụng.Pha loãng chúng đến nồng độ làm việc bằng dung dịch đệm pha loãng.

5. Trạng thái TMB: hút lượng dung dịch cần thiết bằng các đầu đã khử trùng và không đổ lại dung dịch còn lại vào lọ.Chất nền TMB nhạy cảm với ánh sáng, không để chất nền TMB tiếp xúc với ánh sáng trong thời gian dài.

Sử dụng giao thức

1. Xác định số lượng dải cần thiết cho xét nghiệm.Chèn các dải vào khung để sử dụng.Các dải đĩa còn lại không được sử dụng trong xét nghiệm này phải được đóng gói lại trong túi có chất hút ẩm.Đóng chặt túi để bảo quản trong tủ lạnh.

2. Thêm 100μL mỗi dung dịch pha loãng chất chuẩn, mẫu trắng và mẫu vào các giếng thích hợp.Che lại bằng chất bịt kín tấm.Ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng và lắc ở tốc độ 500 vòng/phút.Các mẫu phải được pha loãng với dung dịch đệm STE đến nồng độ thích hợp để xét nghiệm chính xác.

3. Bước rửa: Hút dung dịch và rửa bằng 250μL dung dịch đệm rửa vào từng giếng và để yên trong 30 giây.Loại bỏ hoàn toàn dung dịch đệm rửa bằng cách gắn tấm lên giấy thấm.Tổng cộng rửa 4 lần.

4. Thêm 100μL dung dịch làm việc kháng thể phát hiện đánh dấu biotin vào từng giếng.Che lại bằng chất bịt kín tấm.Ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng và lắc ở tốc độ 500 vòng/phút.

5. Lặp lại bước giặt.

6. Thêm 100μL dung dịch làm việc HRP-streptavidin vào từng giếng.Che lại bằng chất bịt kín tấm.Ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng và lắc ở tốc độ 500 vòng/phút.

7. Lặp lại bước giặt một lần nữa.

8. Thêm 100μL dung dịch cơ chất TMB vào từng giếng.Che lại bằng chất bịt kín tấm.Ủ trong 30 phút ở RT Tránh ánh sáng.Chất lỏng sẽ chuyển sang màu xanh lam khi thêm dung dịch cơ chất.

9. Thêm 50μL dung dịch dừng vào từng giếng.Chất lỏng sẽ chuyển sang màu vàng khi thêm dung dịch dừng.Sau đó chạy máy đọc vi bản và tiến hành đo ngay ở bước sóng 450nm.

Tính toán kết quả

1. Lấy trung bình các số đọc trùng lặp cho từng chất chuẩn, chất kiểm chuẩn và mẫu và trừ đi mật độ quang chuẩn 0 trung bình.Xây dựng đường cong chuẩn với độ hấp thụ trên trục tung (Y) và nồng độ DSRNA trên trục hoành (X).

2. Nên thực hiện tính toán bằng phần mềm khớp đường cong trên máy tính như Curve Expert 1.3 hoặc ELISA Calc trong mô hình khớp phi tuyến tính 5 hoặc 4 tham số.

Hiệu suất

1. Độ nhạy:

giới hạn phát hiện dưới: ≤ 0,001pg/μL (đối với UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0,01pg/μL (đối với 5-OMe-UTP-dsRNA).

giới hạn định lượng dưới: 0,0156 pg/μL (đối với UTP-, pUTP-dsRNA), 0,0312 pg/μL (đối với N1-Me-pUTP-dsRNA), 0,0625 pg/μL (đối với 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Độ chính xác: CV giữa các lần khảo nghiệm ≤10%, CV giữa các lần khảo nghiệm ≤10%

3. Phục hồi: 80%~120%

4.Độ tuyến tính:0,0156-0,5pg/μL(forUTP-,pUTP-dsRNA)0,0312-1pg/μL(forN1-Me-pUTP dsRNA),0,0625-1pg/μL(đối với 5-OMe-UTP-dsRNA).

Cân nhắc

1. Nhiệt độ và thời gian phản ứng TMB là rất quan trọng, vui lòng kiểm soát chúng theo hướng dẫn nghiêm ngặt.

2. Để đạt được độ tái lập và độ nhạy xét nghiệm tốt, việc rửa các đĩa thích hợp để loại bỏ thuốc thử dư thừa không phản ứng là điều cần thiết.

3. Tất cả các thuốc thử phải được trộn kỹ trước khi sử dụng và tránh bị vón cục trong quá trình thêm mẫu hoặc thuốc thử.

4. Nếu tinh thể hình thành trong dung dịch đệm rửa đậm đặc (20x), hãy làm ấm đến 37oC và trộn nhẹ nhàng cho đến khi tinh thể hòa tan hoàn toàn.

5. Tránh xét nghiệm các mẫu có chứa Natri Azide (NaN3), vì nó có thể phá hủy hoạt tính HRP dẫn đến ước tính thấp lượng DSRNA.

6. Tránh nhiễm RNase trong quá trình xét nghiệm.

7. Chất chuẩn/mẫu, kháng thể phát hiện và SA-HRP cũng có thể được tiến hành tại RT mà không cần lắc, nhưng điều này có thể làm giảm độ nhạy phát hiện một lần.Trong trường hợp này, chúng tôi khuyến nghị nên pha loãng tiêu chuẩn DSRNA UTP và pUTP từ 2pg/μL, tiêu chuẩn DSRNA N1-Me-pUTP nên pha loãng từ 4pg/μL và tiêu chuẩn 5-OMe-UTP DSRNA nên pha loãng từ 8pg/μL.Ngoài ra, ủ dung dịch làm việc HRP-streptavidin trong 60 phút ở nhiệt độ phòng.Không sử dụng máy lắc bình vì máy lắc bình có thể cho kết quả không chính xác.

Kết quả điển hình

1. Dữ liệu đường chuẩn

2. Tính toán đường chuẩn

3. Phạm vi phát hiện lớp lót: 0,0312- 1pg/μL